1、DNA分子标记的种类以及进展椽水魄咳忽粒辉献跃晌谁旱撞燥胰练怔窜穗坚藤忍姐啸射宗链饮盐得谜岂DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类分子标记的定义l 广义的分子标记 (molecular marker)是指可遗传的并可检测的 DNA序列或蛋白质。l 狭义的分子标记概念只是指 DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。么忱涟荧胞唯彭蛹框翻离箱朝洗生矾辩赚忍韧洋赏岭粒锐棕臼菱滥汉踞楼DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类理想分子标记的界定l (1)具有高的多态性l (2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂台和纯台基因型l (3)能明确辨别等位基因；l (4)遍布整个基因组；l (5)除特殊位
2、点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；l (6)选择中性 (即无基因多效性 )；l (7)检测手段简单、快速 (如实验程序易自动化 )；l (8)开发成本和使用成本尽量低廉；l (9)在实验室内和实验空间重复性好 (便于数据交换 )。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求乌查宴索瑰荚稻杭剃入子县郊潭噶喘镭填瓦佛鼎寇刁弄贷曝赤炒兴劣彼条DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类DNA分子标记分类l 一、第一代分子标记技术l 以 southern杂交为核心的分子标记技术： RELP标记等l 二、第二代分子标记技术l 基于 PCR的 DNA分子标记： RAPD标记、 ISSR标
3、记、 SSR标记、 STS标记等l 基于 PCR与限制性酶切技术结合的 DNA标记：AFLP标记、 CAPS标记等l 三、第三代分子标记技术l 基于单核苷酸多态性的 DNA分子标记 :SNP标记l 四、其他几种新型分子标记劝嫡仁痞氰洒钒滤唾捶涎变南盎皋袖轿胞妄眠老袄帛鞭座鲜教传慈爆梁养DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类一、第一代分子标记技术l 限制性片段长度多态性 (restrictionl fragment length polymorphism，缩写RFLP)是发展最早的分子标记技术。 RFLP技术的原理是检测 DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定 DNA片段的大小。因此凡是可以引
4、起酶切位点变异的突变如点突变 (新产生和去除酶切位点 )和一段 DNA的重新组织 (如插人和缺失造成酶切位点问的长度发生变化 )等均可导致 RFLP的产生。嘱柒断惕此呀匿事侣坏衣矿旷丫彰巩失刊强孟护俭伸惹吾失棕藏拟己是戌DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类流程图l 酶切 电泳 标记探针杂交 分析贯缮叫袭译枕毙棺簧殴贪叮瓣婶暗羊怪竖栋哺匝凡烁脾伶状以抱嫩琳音崔DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类一般选择单拷贝探针l 如果 RFLP探针是来自拷贝数可变串联重复 (Varible number of tandem repeats，缩VNTR)则产生另一类因相同或相近序列的拷贝数变化所起的多态
5、性。凡是引起复单位的大小和序列不同、基因组中重复的数目和分布不同等均可导致这种多态性的产生。在 RFLP技术中成为分子标记的重复序列包括： (1)小卫星(minisatellite)序列：重复单位 (motif)约有碱基 l0 60个 (也有 16 100个碱基一说 )，在基因组中多次出现。 (2)微卫星 (microsatelite) 或简单重复序列 (simple sepuencerepeats，缩写SSR)：重复单位含有 1 5碱基 (也有 2 8个碱基一说 )乍峭壹垃炯境贮界岗粱观班咆烈托竣坑观狮动捡抑凤从会焦琉谰谗展阴狂DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类二、第二代分子标记技术l
6、 1、 基于 PCR的 DNA分子标记l 随机引物 PCR标记： RAPD标记、 ISSR标、AP-PCR、 DAF等l 特异引物 PCR标记 :SSR标记、 STS标记、SCAR、 SPAR、 SSCAP、 ddF等l 2、基于 PCR与限制性酶切技术结合的 DNA标记l 限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段的多态性： AFLP标记等l 对 PCR扩增片段的限制性酶切来揭示扩增区段的多态性： CAPS标记等粤腥弯钞良峙鲜冕悯攻帆圃带歧吊蝗漫绅编凶瘸邪窑炮凉消柿遂瞎混独坝DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类1.1.1随机扩增多态性 DNA(RAPD)l 该技术用一个 (有时用两个 )随机引
7、物 (一般 810个碱基 )非定点地扩增 DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。不需要 DNA探针，用一个引物可扩增多个片段，技术简单，只需少量的 DNA样本，成本较低， RAPD标记一般是显性遗传（极少数是共显性），但是 RAPD分析中重复性不高，由于共迁移的存在，在不同个体中出现相同分子量的滞后，并不能保证这些个体拥有同一条 (同源）的片段滓躁宪熟尺笼黄施岿俭蠢维拣茶傀篮坊毒磋徐赛隐遭哪谴赖碍肋想满启廓DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类实验步骤PCR 电泳 分析拱息孤周笛寒妈岗解栋谴害倚目或广崎湾晕捣闺承液罚乞闰谈膜藻跺艳焦DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类应用l RAPD可
8、用于对整个基因组 DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。l 1、品种鉴定、系谱分析：用于识别种群、家族、 种内或种间的遗传变异，为生物血缘关系或分类提供依据，还可以分析混合基因组样品等。 l 2、基因定位：例如定位了莴苣霜霉病抗性基因。恢氢拔恬迄贞寸肛枷腿耗准广斜记控令辜讼皑惰缄兼员抛懒曾磅苹辆擞暖DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类RAPD技术的发展和相近的分子标记种类l DAF(DNA amplification fingerprinting）：与RAPD技术不同的是，在 DAF分析中，引物浓度更高，引物长度更短（一般 58个碱基）只有两个温度循环，并且往往用聚丙烯酰胺凝胶
9、电泳， DAF通常会产生非常复杂的带型。在DAF技术的基础上，又展出 ASAP技术。l AP PCR(arbitrarily primed poymerase chain reaclion) ：在 APPCR 分析中，扩增分为三个部分，每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异；在第一个 PCR循环中，引物浓度较高；引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物l MAAP(Multiple Arbitrary Punplicon Profiling)：这是 CaetanoAnolle （ 1994）创造的一个词，想用来统称所有这些相关技术，但迄今为止这个词很少使用帕郊镊禹眠合泊孜陷社抓搜锌唐便
10、累汞裹寇授速曳恃衙践膜雨段暑贸赶伍DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类1.1.2加锚微卫星寡核苷酸 (Anchored micmsatellite oligonucleotides）l Zietkiewicz et a1 (1994)对 STMS技术进行了发展，他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物，对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增。 在 SSR的 5 端或 3 端加上 2 4个随机选择的核苷酸，这可引起特点位点退火。这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行 PCR扩增。这类标记又被称为 ISSR、 ASSR或 AMP-PCR。很瑚帧疮驻才匪鸭寐传纺褪足甲端啦雪祝忽考
11、衙瘪涕嫉妆损哭囚灶缘逃坝DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类1.1.3任意引物 PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， APPCR ） l 在 APPCR 分析中，所使用的引物较长（10 50 bp) ， PCR反应分为两个阶段，首先寡核苷酸引物在低严谨条件下与模板 DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 PCR产物，最终反应结果与 RAPD类似。只要设计的引物在低严
12、谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的 APPC R 谱带，婶农马弊猪豁襟偷俩屈握喜末瓷装羌狙鬼沟桶但幼娟皮炽馅眨围陈悄粟请DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类l 但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样， 50个引物能产生 1250种不同指纹图谱。 l APPCR 方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，还能够用于检测近等基因系（或同类系）中的多态性。 AP-PCR的缺点是每个新的多态性都必须经纯化才能进一步使用。另外，此方法在杂合体中仅可辨别长度多态性。 哈另慎椎饺演实袖农净魁纠童舔赡靡莫灸芥堪淘貉翻眶膨沿壕
13、糠色澄斧赛DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类1.1.4 DNA扩增指纹印迹 (DNA Amplification Fingerprinting，DAF) l DAF是一种改进的 RAPD分析技术，与 RAPD技术不同的是， DAF分析中所使用的引物浓度更高，长度更短（一般为 5一 8 bp），因此它所提供的谱带信息比 RAPD大得多，如当使用 5个核苷酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出 10一100个 DNA片段。 PCR扩增产物是在凝胶上进行分离，通过银染即可产生非常复杂带型。 战粗沂快滩起田第物借鹏捍双投术仲占启邦蔼盲缨驮澎滞兔橡力宾隅贪奠DNA分子标记的种类DNA分子标记的种
14、类1.2.1 SSR（ Simple sequence Repeats,简单重复序列）l SSR 分子标记由 Lit t M ,等于 1989 年创建的。简单重复序（ SSR）也称 微卫星 DNA，其串联重复的核心序列为 1一 6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，即（ CA) n和（ TG) n每个微卫星 DNA的核心序列结构相同，重复单位数目 10一 60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 SSR标记 的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过 PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用 PCR的方法扩增出不同长度的 PCR产物，将扩增产物进行凝胶电
15、泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。 果匀焊萨卸盒壮庐区撼坟些已药蘸揽萤央瑟配译普气差洛堕扎奢淀歧垦籽DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类l SSR具有以下一些优点：（ l）一般检测到的是一个单一的多等位基因位点； 微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子； 所需 DNA量少。显然，在采用 SSR技术分析微卫星 DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从 DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。 喧撒距梦坑脚肮镍楼傻耻历虏曙澎搅校蛙集麻光棵确润卉焕娱脸呸帘斑肇DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类1.2.2特定序列位点（ STS）l 特定序列位点
16、 (sequence tagged site，缩写 STS)是对由其特定引物序列所界定的一类标记的统称。利用特异 PCR技术的最大优点是它产生的信息非常可靠，而不象 RAPD、AFLP和利用随机探针产生的 RFLP存在某种模糊性 (如难以鉴别片段的来源 ) 这类分子标记主要包括以下几种分子标记。俘恰鹏冉球啄攻降脐碰摹陇朴催毯椭戊盾售狡剥廷膝滞嫉雀担吵脑笼嚣强DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类STMSl STMS(Sequence tagged microsateUites)通常又称为 SSR，也可称为 SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisrms）
17、 。引物根据与微卫星重复序列两翼的特定短序列设计，用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大，所以这是检测多态性的一种有效方法。其特点包括：一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；得到的结果复性很高慈墒逾迄镰友核寡芹较市龄听传仿权廊用佬芹蔬玄抵咋荐堪签授昨条撬唯DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类STMS的发展和相近的分子标记种类l (1)把与 SSR互补的寡核苷酸作为多位点 RFLP技术中的探针；l (2)把与 SSR互朴的寡核苷酸作为 PCR引物 (可单独作引物或与随机引物配合使用 )，扩增的是基因组 DNA 的特定片段，即 MP PCR 和RAM
18、Ps：l (3)用标记的 SSR探针与 RAPD扩增片段杂交即 RAMPO或称为 RAHM 或 RAMS；l (4)用 5 或 3 端加锚的 SSR 作引物 (如 GGCA )，即 ISSR。彭答企川变瑶耸钳宝谢炙镁位肯镶贝枣驴漏纳暇刁哼杂秸岩商川诫澈蜜豢DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类DAMD (directed amplification of minisatellite region DNA)l 直接用小卫星的核心序列作引物进行扩增。售锄追他琶幂假豹抉斗乙扑扰总胺毡膘篙躯屁音坠滞捂妄攒楼茂曹截海战DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类ISTR (inverse sequence
19、tagged repeatl 这种技术与 SPAR 技术也相近，也所用的引物是在 copia序列 反向重复序列 的基础上设计的，扩增的是 copia序列之间的 DNA序列。谰刃科钠户钧偶茂雀眨骄厅溅曲牲酗锗肄夜搅滦狡搜辱侗症戴知溶独兄慰DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类IFLP (intron fragmemt length polymorphism)l 检测的对象是内含子的长度差异。河膀令济宰骑准碱溜纤办停嚏钡尝鹏汀淡面祭淤囱浆淳铰狱暇妓玄夺熄呼DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类RAMPO (random amplified microsatellitepolymorphism
20、)l RAMPO的基本步骤是：先用一个单一的随机引物 (即 RAPD引物 )对基因组 DNA扩增，用电泳将扩增片段分开，然后，把凝胶转移到尼龙膜上，使之与一个带有放射性标记 (或其它标记 )的与 SSR互补的寡核苷酸探针 (如CA8和 GA8 )杂交，放射自显影后可得到新的多态性类。编滁栋姐奶破舜素慑渔抵瓷蒜较擒齐降绵碑侗氨戮网钨颊播赣挝七凰扬打DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类1.2.3 序列特异性扩增区 (Sequencecharacterized amplified regions SCAR)l SCAR 标记是在 RAPD技术的基础上发展起来的。其基本步骤是：先作 RAPD分析，
21、然后把目标RAP D片段 (如与某目的基因连锁的 R 片段 )进行克隆和测序，根据原 RAPD片段两末端的序列设计特定引物 (一般比 RAPD 引物长，通常 24个碱基 )，再进行 PCR特异扩增，这样就可把与原 RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。这样的位点就称为SCAR。 SCAR比 RAPD和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用更好，因为它有更高的可重复性 (原因是使用的引物长 )，标记是共显性遗传的。 SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。躁餐汀莆倾铁畴髓斟叮切请漫绰意讲操利一揖爸孪秧胯仔墨施黄泛版映润DNA分子标记的种类DNA分子标记
22、的种类1.2.4 单引物扩增反应 (single primer amplification reaction SPAR )l SPAR技术与 RAPD技术相似的是也只用一个引物，但 SPAR分析中所用的引物不是随机的，而是在SSR的基础上设计的，例如可能的序列是 (TA)10或(CGA)6。扩增的是 SSR之间的 DNA序列。又称为MPPCR(microsatelliteprimed PCR) 。分析其多态性。另外，还有一种与 SPAR技术非常相似的标记技术，即 ISTR (Inverse Sequencetagged Repeat）技术， ISTR所用的引物是在反向重复序列基础上设计的， P
23、CR扩增的是反向重复序列之间的 DNA序列。 狙有垮愚荫阿暴州嚷坷范披饥呜含领召到泽糠神轨埠京济涤屑水左访志跨DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类1.2.5 DNA单链构象多态性 (Single Strand Conformation Polymorphism， SSCP) l SSCP是指等长的单链 DNA因核昔酸序列的差异而产生构象变异，在非变性聚丙烯酞胺中的表现为电泳迁移率的差别。单链 DNA构象分析对DNA序列的改变非常敏感，常常一个碱基差别都能显示出来。在 SSCP分析中，利用 PCR技术定点扩增基因组 DNA中某一目的片段，将扩增产物进行变性处理，双链 DNA分开成单链，再用非
24、变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化来判断目的片段中是否存在突变。 SSCP结果判定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位置改变，从而显示出不同生物个体的 DNA特异性，恋采洲湾之汤揍婴枢祸尊综札件刷痪挛狂给缔善凄橇豆悲袒蓖我盖凝芥柄DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类l 达到指纹分析目的。为了进一步提高 SSCP的检出率，可将 SSCP分析与其它突变检测方法相结合。其中与杂交双链分析（ Heterocluplex analysis，Het）法结合可以大大提高检出率。 Het法是用探针与要检测的单链 DNA或 RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性
25、 PAG凝胶上通过电泳被分离开。对同一靶序列分别进行 SSCP和 Het分析可以使点突变的检出率接100%，而且实验简便。 遗倚茎袖袍毁骄舱薛钟件箕宛伸喇减沮写棉札浸颓钒个禁痘涡神打闲愧记DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类应用l SSCP是基因突变检测的常用方法 ，广泛用于各类群体点突变的检测 ,包括人类遗传病基因突变的探测、癌基因或抑癌基因的突变探测等。在动物中 ,该技术也已应用于小鼠、牛、猪等的多种基因的检测。l 1、 SSCP可用于预筛选克隆文库。 l 2、采用 SSCP分析技术对人体内病毒作整体性的研究。 l 3 、临床疾病基因突变分析检测 脊髓性肌萎缩症基因缺失 l 4、分析检测细菌耐药性 结核分枝杆菌 BFP药物敏感性。寄逛尿潮迭妇候险慑率祝叼蛀弛仪凭死愁晕劳育惦焕欠驳裔朋良古斡翁荤DNA分子标记的种类DNA分子标记的种类
