1、第七章 微生物的生长及其控制,生长和繁殖是保证 微生物获得巨大数量的必要前提。,生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。,生长（growth）：,生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。,繁殖（reproduction）：,生长是一个逐步发生的量变过程， 繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。,在高等生物里这两个过程可以明显分开， 但在低等特别是在单细胞的生物里，由于细胞小， 这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。,生长和繁殖,群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖,个体生长 个体繁殖 群体生长,在一定时间和条件下细胞数量
2、的增加（微生物群体生长）,微生物生长:,在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与 研究大生物时有所不同。,第一节 测定生长繁殖的方法,单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的变化,微生物生长：,微生物生长的测定：,个体计数 群体重量测定 群体生理指标测定,评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；,评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；,客观地反映微生物生长的规律；,一、测生长量,测定生长量的方法很多，适用于一切微生物。,（一）测生长量直接法,（二）测生长量间接法,二、计繁殖数,测定繁殖，一定要一一计算各个体的数目。,单细胞状态的细菌和酵母菌,放线菌和
3、霉菌等丝状生长的微生物,计算其孢子数,计算各个体的数目,link1,（一）计繁殖数直接法,（二）计繁殖数间接法,（一）测生长量直接法,测体积法：粗放型，在刻度离心管中测沉降量,称干重法：精确型，离心法和过滤法获得菌体细胞， 微生物的干重一般为其湿重的1020。,测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法,以E. coli为例，一般液体的培养物（culture）中，细胞浓度通常为2109个mL，100mL培养物约可得1090mg干重的细胞； 高密度培养（high cell-density culture，HCDC）中，细胞产量最高记录可达到174g/L。,（二）测生长量间接法 1.比浊法,用分光光度
4、法对无色的微生物悬浮液进行测定，一般选用450650nm波段。,实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。,在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度（optical density, 即O.D.）表示菌量。,若要连续跟踪某一培养物的生长动态，可用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定，即不必取样。,2.生理指标法,样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。,微生物的生理指标，如氮、碳、DNA、ATP等物质的含量，呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。,常用于对微生物的快速鉴定与检测,一
5、种特定的微生物，每一个细胞中的ATP浓度几乎是一个常数，所以测定这种微生物的ATP含量，即可知其细胞数。,已知细胞数的微生物样品 测定ATP含量,测定未知细胞数的 微生物样品的ATP含量,换算出每个细胞所含的ATP量,即可算出未知样中细胞数,ATP浓度的测定,ELAMPH2O,荧光素酶E,还原型荧光素LH2,E-LH2 AMP复合物,ATP,ppi,Mg2,光,O2,生物发光仪,在这个反应系统中，酶、荧光素和O2都过量时，光的强度与ATP的量成正比。可用生物发光仪测定光照强度，从而换算出ATP的浓度。,生物发光仪现用于各种样品中细胞数的测定。Eg. 临床上测血液、尿液中的菌数；工业上发酵液中的
6、菌数；环境污染状况的测定等。,（一）计繁殖数直接法 1. 计数板直接计数法,指采用计数板（细菌计数板或血球计数板），在光学显微镜下直接观察微生物细胞并进行计数的方法。 （计算一定容积里样品中微生物的数量）,缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,2. 染色后活菌计数法,采用特定的染色技术进行活菌染色，然后用光学显微镜计数的方法。可分别对活菌和死菌进行计数。 例：美蓝 酵母 活细胞无色死细胞蓝色,Eg. 细菌经丫啶橙染色后，在紫外光显微镜下可观察,活细胞橙色荧光,死细胞绿色荧光,将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞细
7、胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。,4. 过滤计数法,当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上（或一定面积中）的细菌数。,3. 比例计数法,（二）计繁殖数间接法,是一种活菌计数法，这是一种依据活菌在液体培养基中会使其变混或在固体培养基上（内）形成菌落的原理而设计。 最常用的是菌落计数法（colony-counting methods）。,1. 平板菌落计数法,可用浇注平板（pour plate）或涂布平板（spread plate）等方法进行。此法适用于各种好氧
8、菌或厌氧菌。,采用培养平板计数法要求操作熟练、准确， 否则难以得到正确的结果。,样品充分混匀；,每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；,同一稀释度三个以上重复,取平均值；,每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；,一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中 一般用 菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示， 而不是直接表示为细胞数。,根据每皿上形成的CFU数乘上稀释度可推算出菌样的含菌数。此方法最为常用，但操作较繁琐且要求操作者技术熟练缺点。,国外出现了微型、快速、商品化的用于菌落计数的小型纸片或密封琼脂板。原理是利用加在培养基中的活菌指示剂TTC（2，
9、3，5氯化三苯基四氮唑），它可使菌落在很微小时就染成易于辨认的玫瑰色。,2. 膜过滤培养菌落计数法,当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。,3. 厌氧菌的菌落计数法,一般可用亨盖特滚管培养法进行。此法设备较复杂，技术难度很高。,简便快速的半固体深层琼脂法，可测定双歧杆菌（bifidobacteria）和乳酸菌（lactic acid bacteria）等厌氧菌活菌数。,原理：试管中的深层半固体琼脂有良好的厌氧性能，并利用其凝固前可作稀释用，凝固后又可代替琼脂平板作菌落计数用的良好性能。,兼有省工、省料、省设备和菌落易辩认等优点！,
