1、功能性食品学 The Science of Functional Foods,授课教师:王雪波 西昌学院食品科学系 2010年3月,主要内容,第1章 绪 论 第2章 功能性食品化学和营养学 第3章 功能性食品评价的基本原理与方法 第4章 功能性食品的设计与开发原理,第3章 功能性食品评价的基本原理与方法,第一节 实验动物与动物试验技术概述 第二节 功能食品的毒理学评价原理与方法 第三节 功能食品的功能学评价,第一节 实验动物与动物试验技术概述,一、动物种属的选择动物试验的目的是外推到人，因此选择与人相似的动物更有说服力，但不同动物对各种化学物质的生物学反应不同，为了减少实验动物与人类之间存在的
2、中间差异，希望在动物试验中所观察到的毒性反应与人类接近，使动物试验结果更能反映人体的情况。一般地，与人类的亲缘关系越接近，其试验结果越有价值，但与人相似的灵长类动物不易获得，且价格昂贵，所以很少采用。为保证人类的安全，可选择对受试物敏感的动物进行试验，如黄曲霉素选择雏鸭，氰化物选择鸟类。,实际操作中往往不了解受试物对何种动物敏感，通常采用成年小鼠或大鼠，这是因为：大、小鼠繁殖力强，容易获得；大、小鼠的价格较低，可节约试验成本；大、小鼠体积小，占地少且操作容易；大、小鼠寿命短，试验周期短；大、小鼠为杂食类动物，食谱与人相似； 大、小鼠的各项生物学指标比较明确，便于对结果进行分析比较。但大、小鼠属
3、于啮齿类动物，无呕吐反射，因此，有呕吐作用的受试物应选择猫等非啮齿类动物。,二、动物品系的选择,所谓品系是指源出于一个共同祖先而具有特定基因型的一群生物。不同品系的同种动 物，可对同一被检物发生不同性质或不同程度反应，即存在品系差异。为了在同种动物中减少这种遗传特性所决定的品系差异，在毒性试验中，最好采用纯品系动物，即“纯种”动物。,三、被检物的给予方式和途径,被检物给予实验动物的方式或被检物进入动物机体的途径，对其在体内引起的生物学反应有显著影响，通常，静脉注射 呼吸道经口经皮。在食品毒理研究中，被检物多以经口方式给予动物，主要有3种方法。,（一）灌胃法,是将液态被检物或固态、气态化合物溶于
4、某种溶剂，配制成一定浓度，装入注射器或其他定量容器，经导管注入胃内。灌胃法能够准确掌握被检物的剂量和接触时间，但对每一只动物需逐一进行，工作量大，而且容易造成损伤，所以一般只适用于1次给予被检物的急性毒性试验。采用灌胃法应注意：灌胃前动物应禁食12h，灌胃后至少3h再喂食；在同一试验中，各组动物的灌胃体积最好一致，即以单位体质量计算所给予的毫升数应一致，小鼠1次灌胃体积以0.1-0.5ml/10g 为宜，大鼠1 次灌胃体积以0.5-1.0ml/100g为宜；特别应防止误插入气管。,（二）吞咽胶囊法 是将被检物装入药用胶囊，强行放到动物咽后壁迫使动物咽下。吞咽胶囊法剂量准确，特别适用于易挥发、易
5、水解和有异味的化合物。药用胶囊分软胶囊和硬胶囊两种，软胶囊适用于油状物质和其他不含水的液体，硬胶囊适用于粉状固体。但无论哪一种胶囊均有一定体积，因此不适用于小鼠和大鼠，家兔、猫、犬等动物可采用此法接触被检物质。 （三）掺入饲料法 是将被检物掺入饲料或饮水中，由实验动物自行摄入。掺入饲料法较简便，无上述方法的缺点，适用于反复多次给予的长期试验。但由于动物摄食量的变化和摄食中的损失，剂量往往不够精确。此外，还应注意以下问题：被检物必须在饲料中混合均匀；在饲料中不挥发，不分解破坏；不影响饲料感官性状如异味等，不影响动物摄食量；掺入饲料中的被检物的数量不应超过饲料质量的10%； 饲料最好经常新鲜配制，
6、不可存放过久。,第二节 功能食品的毒理学评价原理与方法,以单一已知化学成分为原料的受试物，应提供受试物（必要时包括其杂质）的物理、化学性质（包括化学结构、纯度、稳定性等）。 含有多种原料的配方产品。应提供受试物的配方，必要时应提供受试物各组成成分，特别是功效成分或代表性成分的物理、化学性质（包括化学名称、结构、纯度、稳定性、溶解度等）及检测报告等有关资料。 提供原料来源、生产工艺、推荐人体摄入量、使用说明书等有关资料。 受试物应是符合既定配方和生产工艺的规格化产品，其组成成分、比例及纯度应与实际产品相同。,一、对受试物的要求,受试物进行不同的试验时应针对试验的特点和受试物的理化性质进行相应的样
7、品处理。人体推荐量较大的受试物的处理：设计试验剂量会超过动物的最大灌胃剂量或超过掺入饲料中的规定限量（10重量），可允许去除既无功效作用又无安全问题的辅料部分后进行试验。袋泡茶类受试物的处理：可用该受试物的水提取物进行试验，提取方法应与产品推荐饮用的方法相同。提取2次，将提取液合并浓缩至所需浓度，并标明该浓缩液与原料的比例关系。,对受试物处理的要求,二、对受试物处理的要求,对受试物处理的要求,液体品需要进行浓缩处理时，应采用不破坏其中有效成分的方法。可使用温度6070 减压或常压蒸发浓缩、冷冻干燥等方法。含有毒性较大的人体必需营养素（如维生素A、硒等）的保健食品的处理：如产品配方中含有某一毒性
8、较大的人体必需营养素，在按其推荐量设计试验剂量时，如该物质的剂量达到已知的毒作用剂量，在原有剂量设计的基础上考虑增加去除该物质或降低该物质剂量的受试物剂量组，以便对保健食品中其它成分的毒性作用及该物质与其它成分的联合毒性作用做出评价。,益生菌等微生物类保健食品处理：益生菌类或其它微生物类等保健食品在进行Ames试验或体外细胞试验时，应将微生物灭活后进行。 以鸡蛋等食品为载体的特殊保健食品的处理：在进行喂养试验时，允许将其加入饲料，并按动物的营养需要调整饲料配方后进行试验。,三、食品安全性毒理学评价试验的四个阶段和内容,第一阶段：急性毒性试验，包括经口急性毒性LD50，联合急性毒性，一次最大耐受
9、量试验； 第二阶段：遗传毒性试验，30 天喂养试验，传统致畸试验； 第三阶段：亚慢性毒性试验（90天喂养试验）、繁殖试验、代谢试验； 第四阶段：慢性毒性试验和致癌试验。,（一）以普通食品和卫生部规定的药食同源物质以及允许用作保健食品的物质以外的动植物或动植物提取物、微生物、化学合成物等为原料生产的保健食品，应对该原料和用该原料生产的保健食品分别进行安全性评价。该原料原则上按以下四种情况确定试验内容。用该原料生产的保健食品原则上须进行第一、二阶段的毒性试验，必要时进行下一阶段的毒性试验。,四、不同保健食品选择毒性试验的原则要求,1、国内外均无食用历史的原料或成分作为保健食品原料时，应对该原料或成
10、分进行四个阶段的毒性试验。2、仅在国外少数国家或国内局部地区有食用历史的原料或成分，原则上应对该原料或成分进行第一、二、三阶段的毒性试验，必要时进行第四阶段毒性试验。3、在国外多个国家广泛食用的原料，在提供安全性评价资料的基础上，进行第一、二阶段毒性试验，根据试验结果决定是否进行下一阶段毒性试验。,（二）以卫生部规定允许用于保健食品的动植物或动植物提取物或微生物（普通食品和卫生部规定的药食同源物质除外）为原料生产的保健食品，应进行急性毒性试验、三项致突变试验（Ames 试验或V79/HGPRT 基因突变试验，骨髓细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验，及TK基因突变试验或小鼠精子畸形分析
11、（或睾丸染色体畸变分析试验）中的任一项）和30 天喂养试验，必要时进行传统致畸试验和第三阶段毒性试验。,（三）以普通食品和卫生部规定的药食同源物质为原料生产的保健食品，分以下情况确定试验内容： 1、以传统工艺生产且食用方式与传统食用方式相同的保健食品，一般不要求进行毒性实验。 2、用水提物配制生产的保健食品，如服用量为原料的常规用量，且有关资料未提示其具有安全性的，一般不要求进行毒性试验。如服用量大于常规用量时，需进行急性毒性试验、三项致突变试验和30 天喂养试验，必要时进行传统致畸试验。 3、用水提以外的其它常用工艺生产的保健食品，如服用量为原料的常规用量时，应进行急性毒性试验、三项致突变试
12、验。如服用量大于原料的常规用量时，需增加30天喂养试验，必要时进行传统致畸试验和第三阶段毒性试验。,（四）用已列入营养强化剂或营养素补充剂名单的营养素的化合物为原料生产的保健食品，如其原料来源、生产工艺和产品质量均符合国家有关要求，一般不要求进行毒性试验。（五）针对不同食用人群和（或）不同功能的保健食品，必要时应针对性的增加敏感指标及敏感试验。,五、保健食品安全性毒理学评价试验的目的和结果判定,（一）毒理学试验的目的,1、急性毒性试验：测定LD50，了解受试物的毒性强度、性质和可能的靶器官，为进一步进行毒性试验的剂量和毒性观察指标的选择提供依据，并根据LD50 进行毒性分级。 2、遗传毒性试验
13、：对受试物的遗传毒性以及是否具有潜在致癌作用进行筛选。 3 、30 天喂养试验：对只需进行第一、二阶段毒性试验的受试物，在急性毒性试验的基础上，通过30 天喂养试验，进一步了解其毒性作用，观察对生长发育的影响，并可初步估计最大未观察到有害作用剂量。 4、致畸试验：了解受试物是否具有致畸作用。,毒理学试验的目的,5、亚慢性毒性试验（90 天喂养试验，繁殖试验）：观察受试物以不同剂量水平经较长期喂养后对动物的毒作用性质和靶器官，了解受试物对动物繁殖及对子代的发育毒性，观察对生长发育的影响，并初步确定最大未观察到有害作用剂量，为慢性毒性和致癌试验的剂量选择提供依据。6、代谢试验：了解受试物在体内的吸
14、收、分布和排泄速度以及蓄积性，寻找可能的靶器官；为选择慢性毒性试验的合适动物种（species）、系（strain）提供依据；了解代谢产物的形成情况。,毒理学试验的目的,7、慢性毒性试验和致癌试验：了解经长期接触受试物后出现的毒性作用以及致癌作用；最后确定最大未观察到有害作用剂量和致癌的可能性，为受试物能否应用于保健食品的最终评价提供依据。,（二）各项毒理学试验结果的判定,1、 急性毒性试验 如LD50 小于人的可能摄入量的100 倍，则放弃该受试物用于保健食品。如LD50 大于或等于100 倍者，则可考虑进入下一阶段毒理学试验。 如动物未出现死亡的剂量大于或等于10g/kgBW（涵盖人体推荐
15、量的100 倍），则可进入下一阶段毒理学试验。 对人体推荐量较大和其它一些特殊原料的保健食品，按最大耐受量法最大给予剂量动物未出现死亡，也可进入下一阶段毒理学试验。,各项毒理学试验结果的判定,2、遗传毒性试验 （1）如三项试验（Ames 试验或V79/HGPRT 基因突变试验，骨髓细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验，及TK 基因突变试验或小鼠精子畸形分析（或睾丸染色体畸变分析试验）中的任一项）中，体外或体内有一项或以上试验阳性，一般应放弃该受试物用于保健食品。（2）如三项试验均为阴性，则可继续进行下一步的毒性试验。,各项毒理学试验结果的判定,3、30 天喂养试验 （1）对只要求进行第
16、一、二阶段毒理学试验的受试物，若30 天喂养试验的最大未观察到有害作用剂量大于或等于人的可能摄入量的100 倍，综合其它各项试验结果可初步做出安全性评价。（2）对于人的可能摄入量较大的保健食品，在最大灌胃剂量组或在饲料中的最大掺入量剂量组未发现有毒性作用，综合其它各项试验结果和受试物的配方、接触人群范围及功能等有关资料可初步做出安全性评价。,各项毒理学试验结果的判定,（3）若最小观察到有害作用剂量小于人的可能摄入量的100 倍，或观察到毒性反应的最小剂量组其受试物在饲料中的比例小于或等于10，且剂量又小于人的可能摄入量的100倍，原则上应放弃该受试物用于保健食品。但对某些特殊原料和功能的保健食
17、品，在小于人的可能摄入量的100 倍剂量组，如果个别指标实验组与对照组出现差异，要对其各项试验结果和受试物的配方、理化性质及功能和接触人群范围等因素综合分析以判断是否为毒性反应后，决定该受试物可否用于保健食品或进入下一阶段毒性试验。,各项毒理学试验结果的判定,4、传统致畸试验以LD50 或30 天喂养实验的最大未观察到有害作用剂量设计的受试物各剂量组，如果在任何一个剂量组观察到受试物的致畸作用，则应放弃该受试物用于保健食品，如果观察到有胚胎毒性作用，则应进行进一步的繁殖试验。,各项毒理学试验结果的判定,5、90 天喂养试验、繁殖试验 （1）国外少数国家或国内局部地区有食用历史的原料或成分，如最
18、大未观察到有害作用剂量大于人的可能摄入量的100 倍，可进行安全性评价。若最小观察到有害作用剂量小于或等于人的可能摄入量的100 倍，或最小观察到有害作用剂量组其受试物在饲料中的比例小于或等于10，且剂量又小于或等于人的可能摄入量的100 倍，原则上应放弃该受试物用于保健食品。 （2）国内外均无食用历史的原料或成分，根据这两项试验中的最敏感指标所得最大未观察到有害作用剂量进行评价的原则是：,最大未观察到有害作用剂量小于或等于人的可能摄入量的100 倍者表示毒性较强，应放弃该受试物用于保健食品。 最大未观察到有害作用剂量大于100 倍而小于300 倍者，应进行慢性毒性试验。 大于或等于300 倍
19、者则不必进行慢性毒性试验，可进行安全性评价。,6、慢性毒性和致癌试验,（1） 慢性毒性试验所得的最大未观察到有害作用剂量进行评价的原则是： 最大未观察到有害作用剂量小于或等于人的可能摄入量的50 倍者，表示毒性较强，应放弃该受试物用于保健食品。 未观察到有害作用剂量大于50 倍而小于100 倍者，经安全性评价后，决定该受试物是否可用于保健食品。 最大未观察到有害作用剂量大于或等于100 倍者，则可考虑允许用于保健食品。,6、慢性毒性和致癌试验,（2）根据致癌试验所得的肿瘤发生率、潜伏期和多发性等进行致癌试验判定的原则是：凡符合下列情况之一，并经统计学处理有显著性差异者，可认为致癌试验结果阳性。
20、若存在剂量反应关系，则判断阳性更可靠。 肿瘤只发生在试验组动物，对照组中无肿瘤发生。 试验组与对照组动物均发生肿瘤，但试验组发生率高。,试验组动物中多发性肿瘤明显，对照组中无多发性肿瘤，或只是少数动物有多发性肿瘤。 试验组与对照组动物肿瘤发生率虽无明显差异，但试验组中发生时间较早。,（一）试验指标的统计学意义和生物学意义：在分析试验组与对照组指标统计学上差异的显著性时，应根据其有无剂量反应关系、同类指标横向比较及与本实验室的历史性对照值范围比较的原则等来综合考虑指标差异有无生物学意义。此外如在受试物组发现某种肿瘤发生率增高，即使在统计学上与对照组比较差异无显著性，仍要给以关注。,六、保健食品毒
21、理学安全性评价时应考虑的问题,（二）生理作用与毒性作用：对实验中某些指标的异常改变，在结果分析评价时要注意区分是生理学表现还是受试物的毒性作用。 （三）时间-毒性效应关系：对由受试物引起的毒性效应进行分析评价时，要考虑在同一剂量水平下毒性效应随时间的变化情况。,（四）特殊人群和敏感人群：对孕妇、乳母、或儿童食用的保健食品，应特别注意其胚胎毒性或生殖发育毒性、神经毒性和免疫毒性。 （五）推荐摄入量较大的保健食品：应考虑给予受试物量过大时，可能影响营养素摄入量及其生物利用率，从而导致某些毒理学表现，而非受试物的毒性作用所致。,（六）含乙醇的保健食品：对试验中出现的某些指标的异常改变，在结果分析评价
22、时应注意区分是乙醇本身还是其它成分的作用。（七）动物年龄对试验结果的影响：对某些功能类型的保健食品进行安全性评价时，对试验中出现的某些指标的异常改变，要考虑是否因为动物年龄选择不当所致而非受试物的毒性作用，因为幼年动物和老年动物可能对受试物更为敏感。,（八）安全系数：将动物毒性试验结果外推到人时，鉴于动物、人的种属和个体之间的生物学差异，安全系数通常为100，但可根据受试物的原料来源、理化性质、毒性大小、代谢特点、蓄积性、接触的人群范围、食品中的使用量和人的可能摄入量、使用范围及功能等因素来综合考虑其安全系数的大小。,（九）人体资料：由于存在着动物与人之间的种属差异，在评价保健食品的安全性时，
23、应尽可能收集人群食用受试物后反应的资料；必要时在确保安全的前提下，可遵照有关规定进行人体试食试验。,（十）综合评价：在对保健食品进行最后评价时，必须综合考虑受试物的原料来源、理化性质、毒性大小、代谢特点、蓄积性、接触的人群范围、食品中的使用量与使用范围、人的可能摄入量及保健功能等因素，确保其对人体健康的安全性。对于已在食品中应用了相当长时间的物质，对接触人群进行流行病学调查具有重大意义，但往往难以获得剂量反应关系方面的可靠资料；对于新的受试物质，则只能依靠动物试验和其它试验研究资料。然而，即使有了完整和详尽的动物试验资料和一部分人类接触者的流行病学研究资料，由于人类的种族和个体差异，也很难做出
24、保证每个人都安全的评价。即绝对的安全实际上是不存在的。根据试验资料，进行最终评价时，应全面权衡做出结论。,（十一）保健食品安全性的重新评价：安全性评价的依据不仅是科学试验的结果，与当时的科学水平、技术条件以及社会因素均密切有关。因此，随着时间的推移，很可能结论也不同。随着情况的不断改变，科学技术的进步和研究的不断进展，有必要对已通过评价的受试物进行重新评价，做出新的科学结论。,第三节 功能食品的功能学评价,功能学评价，是对功能性食品的保健功能进行动物或（和）人体试验，加以评价确认。功能性食品所含有的生理功效，必须是明确而肯定的，且经得起科学方法的验证，同时具有重现性。,一、对受试物的要求,1、
25、应提供受试样品的原料组成或尽可能提供受试样品的物理、化学性质（包括化学结构、纯度、稳定性等）有关资料。 受试样品必须是规格化的定型产品，即符合既定的生产工艺、配方及质量标准。 提供受试样品的安全性毒理学评价的资料以及卫生学检验报告，受试样品必须是已经过安全性毒理学评价确认为安全的物质。功能学评价的样品与安全性毒理学评价、卫生学检验的样品必须为同一批次。 应提供功效成分或特征成分、营养成分的名称及含量。 如需提供受试样品违禁药物检测报告时，应提交与功能学评价同一批次产品的违禁药物检测报告。,二、对实验动物的要求,根据各项试验的具体要求，合理选择试验动物。常用大鼠和小鼠，品系不限。 动物的性别不限
26、，可根据试验需要进行选择。实验动物的数量要求为小鼠每组1015只（单一性别），大鼠每组812只（单一性别）。动物的年龄可根据具体试验需要而定，但一般多选择成年动物。 实验动物应符合国家对实验动物的有关规定。,三、对给受试样品剂量及时间的要求,各种动物实验至少应设3个剂量组，另设阴性对照组，必要时可设阳性剂量组或空白对照组。剂量选择应合理，尽可能找出最低有效剂量。在3个剂量组中，其中一个剂量应相当于人体推荐摄入量（折算为每公斤体重的剂量）的5倍（大鼠）或10倍（ 小鼠），且最高剂量不得超过人体推荐摄入量的30倍（特殊情况除外），受试样品的功能试验剂量必须在毒理学评价确定的安全剂量范围之内。 给受
27、试样品的时间应根据具体试验而定，一般为30天。当给与受试样品的时间已达30天而试验结果仍为阴性时，则可终止实验。,四、对给受试样品方式的要求,必须经口给予受试样品，首选灌胃。如无法灌胃则加入饮水或掺入饲料中，计算受试样品的给予量。五、对合理设置对照组的要求 以载体和功效成分（或原料）组成的受试样品，当载体本身可能具有相同功能时，应将该载体作为对照。,六、功能学评价的影响因素,1、人的可能摄入量：除一般人群的摄入量外，还应考虑特殊的和敏感的群体（如儿童、孕妇及高摄入量群体）。 2、人体资料：由于存在动物与人体之间的种属差异，在将动物试验结果外推到人时，应尽可能收集人群服用受试物后的效应资料。若体外或体内动物试验未观察到或不宜观察到食品的保健效应，或观察到不同的效应，而有关资料提示对人体有保健作用时，在保证安全的前提下，应进行必要的人体试食试验。 3、结果的重复性和剂量反应关系：在将评价程序所列试验的阳性结果用于评价食品的保健作用时，应考虑结果的重复性和剂量反应关系，并由此找出其最低有效剂量。,
