1、生物芯片技术及其在食品检测中的应用摘要：生物芯片技术（包括基因芯片，蛋白芯片等）以及相应的生物信息学工具，正开始从医学应用领域逐渐应用于其他新的领域，比如食品安全领域。本文主要介绍了目前的生物芯片在食品安全领域相关检测方面的最新应用情况。关键词：生物芯片；食品检测；应用食品安全问题是一个全球性的问题。据世界卫生组织估计，仅在亚太地区每年就有 70 多万人死于食物中毒。近年来，世界上相继发生的诸多危及人身健康的畜禽及其制品的食品安全事件，不仅直接关系到人类的健康生存，也严重影响到经济和社会的发展。在肉制品的安全事件中，食源性疾病占有相当的数目和种类，其特点是易爆发、传染性强、流行范围广、危害严重
2、。但由于检测技术的滞后，现行的食品卫生标准不能对食源性病毒进行有效的检测。而生物芯片应用于食源性病毒的检测，可大大提高检测的灵敏度和专一性，缩短了检测所需的时间，并为食源性病毒检测方法的完善、标准化及实际应用带来了希望。民以食为天，食以安为先。 充足、 营养和安全的食品是人类生存的基本需要。生物芯片在生物安全和食品安全检测方面的应用刚刚开始，但已显示出优势。1 生物芯片技术概述1.1 生物芯片生物芯片的最初构想来源于 Affymetrix 公司的前身 Affy -max 公司里的一次即兴的建议。由 Fodor 组织半导体专家和分子生物学专家共同研制出来的。1991 年利用光蚀刻光导合成多肽，1
3、993 年设计了一种寡核苷酸生物芯片，1994 年又提出用光导合成的寡核苷酸芯片进行 DNA 序列快速分析，到 1996 年制造出世界上第一块商业化的生物芯片 1。生物芯片是根据生物大分子间具有特异相互识别的能力，利用微电子、微机械、微加工技术,在玻璃、硅片或尼龙膜等各种固体支持物上构建的微型生化分析系统，通过计算机对反应信号搜集处理，可对细胞、糖、脂、核酸、蛋白质以及其它小分子物质进行准确、快速、大信息量的检测。生物芯片使样品检测、分析过程高通量、连续化、集成化、微型化、自动化。1.2 生物芯片分类芯片种类较多，根据芯片上的固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片
4、；另外根据原理还可分为元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片；以其片基的不同分为无机片基和有机合成物片基;按其应用的不同可以分为表达谱芯片、诊断芯片、芯片；按其结构的不同可以分 DNA 阵列和寡核苷酸芯片。其中应用最多，应用范围最广的生物芯片是基因芯片。1.21 基因芯片 又称 DNA 微探针阵列(Microarray)，是生物芯片的一种。基因芯片产生的基础是分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技术、激光技术和计算机科学的发展及其有机结合2。基因芯片原理根据核酸的分子杂交衍生而来，即应用固体基因表面上集成已知序列的基因探针对未知序列的核酸序列进行杂交检测。样品与探针杂
5、交后，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描。算机系统对每一探针上的荧光信号作比较和杂交探针位置的检测,分析得出结果，实现基因信息的快速检测 3。其检测的步骤如下 4:样品处理、扩增、然后标记的靶基因与固化处理的基因芯片进行核酸杂交、洗涤、检测信息、数据处理、综合信息处理。基因芯片技术的主要特点为：技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低。1.2.2 蛋白质芯片蛋白质芯片 又称为蛋白质微阵列 (proteinmicroarray)是大量的蛋白质分子(例如抗体或抗原分子)或肽链有序排列固定在载体薄片上形成的。蛋白质或肽能特异性地与配体分子(如抗体或抗原)结
6、合的原理，芯片上的蛋白质分子或肽链与样品中的相关成分发生反应,然后加入标记分子，并用阅读仪分析和存储结果，这就是蛋白质芯片的工作原理 5。与传统的研究方法相比有以下特点：( 1)蛋白芯片是一种高通量的研究方法,能在一次实验中提供大量的信息,使我们能够全而、准确地研究蛋白表达谱；( 2)灵敏度高，它可以检测出蛋白样品中微量蛋白的存在，检测水平已达 ng 级； ( 3)所需的样品量极少。2 生物芯片在食品检测中的应用2.1 在转基因食品检测中的应用就目前转基因食品检测中常用的 ELIS 和 PCR 技术而言，最大的缺点是检测范围窄,效率低,无法高通大规模地同时检测多种样品，尤其是对转基因背景一无所
7、知的情况下，对各种候选待检基因序列或蛋白的逐一筛查几乎是不可能的。生物芯片具有高通量、微型化、自动化和信息化的特点,是转基因食品检测的方向。现已广泛应用于大豆、玉米、油菜、棉花等农作物样品的检测。在农业上,基因芯片筛选发生基因突变的食品原料作物；寻找高产、抗虫、抗病、经济价值高的作物，进行农药的筛选；检测各种作物的基因组；通过比较差异表达寻找新基因。许小丹等 6制备了检测及鉴定转基因大豆的寡核苷酸芯片。该芯片探针特异性好、灵敏度高，检测极限为 0.1ng(DNA)，从而消除假阴性概率，灵敏度优于凝胶电泳检测。上海博星基因芯片研究所得研究人员采用基因芯片对大豆、玉米、油菜、棉花等转基因农作物进行
8、检测，该芯片不仅可以了解 4 中农作物的转基因背景，还可以适应不同样品品种的不同生物学背景 7。根据基因芯片技术的特点，仅靠一个实验就能筛选出大量的各种转基因食品。因此，生物芯片可以传统方法的不足，是食品安全检测最具潜力的技术之一，是转基因食品检测的方向。2.2 在识别不明肉类中的应用2004 年 3 月法国“biomerieux”公司推出了一种能够识别不明肉类的新型基因芯片8。名为“食品专家-ID”检测方法，包括精心选自 33 种脊椎动物的 88000 个探针，这些动物包括鸵鸟、非洲鳗和猫，人类 DNA 也包括在内、不过主要作为“对照” 。 芯片由affymetrix 公司制造，该芯片将用于
9、肉类产品的品质证明，检测的结果是给出一张“身份识别卡” ，在上面开列出所有检测到的物种名称。这种芯片不但能揭示出标价 100 美元的鹅肝酱是否掺入猪肝等廉价替代品，而且可以检测出吃了脊椎动物副产品的动物的肉制品中所携带的病毒蛋白，如疯牛病等，还能用于确认某些指标要求严格的食品是否达标。2.3 在细菌检测方面的应用细菌污染是食品最常见的污染。因此，食品中病原性细菌检测是食品卫生安全检测中一个重要的方面。细菌对食品污染，不但会造成巨大的经济损失，致病细菌的存在还会严重威胁人类的健康 8。传统的细菌培养需要复杂的营养条件，种属鉴定与抗生素敏感试验所需的培养法耗时较长。基因芯片技术细菌检测,在 PCR
10、 基础上的病原检测系统的应用，大大缩短了诊断时间，使那些不能培养或很难培养的细菌也得到快速诊断。选择从水、食品和临床样品中分离有关致病菌或卫生指标菌，并以沙门菌、志贺菌和大肠埃希菌的标准菌株作对照,观察基因芯片检测致病菌的敏感性、特异性，并与常规检测方法、PCR 检测方法作对比。结果表明，采用基因芯片技术几乎可以检测上述所有的细菌，检测结果与传统方法符合率为 98%，与 PCR 检测结果的一致性为 96.3%。基因芯片技术检测时间约 4h；而PCR 检测需要 8h；传统的方法需 25d。基因芯片技术引入微生物检测领域为建立快捷高效的检测方法提供了技术平台，用于食品、水质中常见细菌/霉菌检测的基
11、因芯片已经问世 9。2.4 在兽药残余检测中的应用随着人们对动物性食品需求量的增加，动物性食品中的兽药残留问题也越来越成为全社会共同关注的焦点。同时兽药残留对公共卫生和环境安全有很大危害。蛋白芯片，采用荧光标记免疫竞争法可测定样品中的兽药残留含量：与常规检测手段相比，兽药残留检测芯片系统具有样品前处理简单、多残留物检测、检测速度快和检测指标成本低等突出优点10。北京出入境检验检疫局与北京博奥生物芯片中心合作开发了兽药残留蛋白芯片检测平台，该平台系统可对猪肉、猪肝、鸡肉、鸡肝等组织中磺胺二甲嘧啶、磺胺喹啉、磺胺甲唑、 磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异唑、磺胺噻唑、恩诺沙星、氯霉素、链霉素及双氢链霉素l0
12、种兽药残留量进行定量检测，具有前处理简单，灵敏度高，特异性好，检测速度快，检测通量高， 质控体系严密等优点，可广泛应用于进出口检验、常规筛检等领域 11。2.5 在食品营养机理研究中的应用生物芯片技术将在食品营养研究领域中发挥重要作用。利用生物芯片技术研究营养素与蛋白和基因表达的关系，将为揭示肥胖的发生机理及预防打下基础；营养与肿瘤相关基因表达的研究，为揭示抗病和预防机理提供理论依据。如癌基因、抑癌基因的表达与突变；营养与心脑血管疾病关系的分子水平研究；营养与高血压、糖尿病、免疫 系统疾病、神经、内分泌系统关系的分子水平研究。还可以利用生物芯片技术研究金属硫蛋白金属硫蛋白基因以及锌转运体基因等
13、与锌等微量元素的吸收、转运与分布的关系;视醇受体/视黄醇受体基因与维生素 A 的吸收、转运与代谢的关系等 12。2.6 在食品微生物检测中的应用食品卫生检测中的 1 个重要方面是及时、准确地检测出食品中的病原性微生物，这些致病微生物的存在会严重威胁人类的健康。传统的生化培养检测方法需要经过几天的微生物培养和复杂的计数,操作繁杂，不能及时反映生产过程或销售过程中食品的污染情况，且灵敏度不高，使得食品不能得到有效地监测,给消费者的健康带来威胁。PCR 法快速,比前者灵敏，但成本高，假阳性多，也不是最好的检测食品微生物污染的方法。Appelbaum 在对几种细菌进行鉴别时,设计了 1 种鉴别诊断芯片
14、，其原理是：一方面从高度保守基因序列出发，即以各菌种间的差异序列为靶基因；另一方面选择同种细菌不同血清型所特有的标志基因为靶基因，固着于芯片表面，同时还含有细菌所共有的 16S rDNA 保守序列以确定为细菌感染标志。该法不仅敏感度高于传统方法，而且操作简单，重复性好 13。2.7 食源性病毒检测方面的应用在动物疫病病原菌的检测方面，已开发了分别用于马毒性动脉炎病毒（EAV） 、 非洲马瘟病毒（AHS）/马鼻肺炎病毒（EHV-4） 、马冠状病毒（ECV）和西尼罗热病毒（WNV） 种马病毒检测和犬病病毒检测的基因芯片。可将基因芯片技术用于食源性致病病毒诺如病毒、轮状病毒、甲肝病毒、星状病毒和脊髓
15、灰质炎病毒的检测。陈广全等 14采用基因芯片方法检测贝类食品中引起人类腹泻的种食源性致病病毒。该基因芯片具有良好的特异性，在种病毒之间无交叉反应，其灵敏度与荧光 PCR 方法基本一致。2.8 在食品毒理学方面的应用传统的食品毒理学研究必须通过动物实验模式来进行模糊评判，它们在研究毒物的整体毒性效应和毒物代谢方面具有不可替代的作用。但是,这不仅需要消耗大量的动物，而且往往费时费力。另外，所用动物模型由于种属差异，得出的结果往往并不适宜外推至人。动物实验中所给予的毒物剂量也远远大于人的暴露水平，所以不能反映真实的暴露情况。生物芯片技术的应用将给毒理学领域带来一场革命。生物芯片可以同时对几千个基因的
16、表达进行分析，为研究新型食品资源对人体免疫系统影响机理提供完整的技术资料。通过对单个或多个混合体有害成分的分析，确定该化学物质在低剂量条件下的毒性，从而推断出其最低限量 15。3 存在的问题生物芯片技术作为一种新兴的生物技术。虽然各国学者已经看到了它的重要应用价值,但由于相关领域的现状，使该技术的迅速发展和广泛应用受到了一定的限制。制备芯片的前 提是需要大量的、已知的、准确的核酸序列或蛋白质种类的信息资料。其中有一些已经被收集到国际数据库中，如 Gene Bank、EMB L、DDBJ 等，通过一定的程序可以查询。但仍有大量的基因片段其序列尚未被准确认定或尚未公开。特别是全长的 cDNA 难度
17、更大。这些情况无疑使芯片的种类和原料受到影响；信号检测系统，计算机分析系相应软件，到目前为止，市场价格仍极为昂贵，一般实验室难以承受，如再加上芯片制作系统 (点样装置等)和杂交反应系统。总价格可达几百万人民币，这在很大程度上影响了芯片技术的应用范围 16。芯片技术本身也存在一些问题 17，大致可概括为(l)靶 DKA 与寡核昔酸探针的杂交存在错配、未配情况；(2)靶 DNA 自身二级甚至三级结构的形成；(3)靶 DNA 中存在串联的重复序列会使计算机重构序列时产生分支点而无法排序。此外增加信号检测的灵敏度、芯片的特异性方面也有待于进一步提高；样品制备和标记操作需简化。4 展望生物芯片作为新兴的
18、分子生物学技术，具有快速、高通量、高特异性等优点，将该技术应用于食品安全领域，必然给生物芯片的应用及食品安全检测水平的提高带来新的契机，使生物芯片技术走出实验室，从研究走入了与寻常百姓生活密切相关的食品安全领域。该技术的普及应用，必然会带来检测速度的加快和检测费用的降低，从而大大加强执法机构如食品安全检测机构、出入境检验检疫局、商检局等的执法力度，确保食品安全，创造良好社会效益。参考文献1 陈庆山，王伟权，杨庆凯等.生物芯片工作原理及其研究进展.生物技术，2003,13（6）:61-63.2 张宝珠.基因芯片技术J. 实验室科学, 2005, (4)2:126.3 邓平建.基因芯片技术(上 )
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