1、第十三章 设备与管道的 清洗和杀菌,染菌的危害：,使生物反应的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力下降。 杂菌产生代谢产物，使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降。 有些杂菌会分解产物，使生产失败。 杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常。 如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。,防止染菌的措施,培养基灭菌 通气发酵中进行空气过滤除菌 采用处于对数生长期，不含杂菌的种子液 注意接种室、设备及管路的灭菌 注意发酵中的无菌操作，例如流加物料、消泡剂的灭菌。,设备与管道的清洗与杀菌的必要性,污染危险降至最小 防止设备或管道污垢的生成 保证一定的卫生要求,需要清
2、洗除去的污脏物的种类随发酵生产及过程产物等不同而改变的：,培养基贮罐很易结垢变脏。 发酵罐也易污染结垢，尤其是培养基在罐中实消时。 用于分离回收产物的设备和管路因营养物质的积聚而导致高污染。 细胞及蛋白质等的残留积聚和结垢，会孕育发酵培养的交叉感染的可能性。 设备外部的清洗：及时清洗除去泄漏的营养物质。,第一节 常用清洗剂、清洗方法及设备,一、生物工业常用清洗剂 清洗剂：能溶解或分解有机物，分散固形物，具有漂洗、多价螯合和杀菌作用。 目前的清洗剂都是由碱或酸、表面活性剂、磷酸盐或螯合剂等复配而成。 烧碱溶液是很好的蛋白质和脂肪洗涤剂。 硅酸钠是良好的水溶液分散剂，对积垢的分散十分有效。 磷酸三
3、钠因为有良好的分散性和乳化性，使用也较普遍。 酸只用于溶解碳酸盐积垢和某些金属盐积垢。,表13-1 典型洗涤剂溶液配方,单位：g/L,2消毒杀菌剂最常用的化学消毒剂是次氯酸钠。近几年，二氧化氯逐渐取代次氯酸钠。 3特殊清洗试剂 色谱分离柱树脂的处理：易被烧碱等破坏，可使用6M的氯化胍洗脱蛋白质。,二、设备、管路、阀门等的清洗,人工或半机械法清洗 CIP清洗系统（在位清洗），使清洗过程达到自动化或半自动化。 1、管件清洗,清洗过程中液流速度1.5m/s；20min。 清洗剂清洗时温度不能太高，75为最高。 发酵反应结束后马上清洗。 设备清洗后干燥备用。,2罐的洗涤,小型罐：在罐内放入洗涤剂浸泡。
4、 大型罐：灌顶喷洒洗涤。 喷射洗涤设备：球形静止喷洒器和旋转式喷洒器。,3生物加工下游过程设备的清洗,采用CIP清洗系统（在位清洗），洗涤剂和清水轮换洗涤 采用去离子水 PHLC介质对碱较敏感，不能耐受NaOH等碱性洗涤剂，可用硅酸钠代替。若色谱系统使用的是软性介质，则只能在低压力和流速下进行清洗。某些情况下（如在位冲洗）不能提供充足的清洗度时，应将填充基质卸下来再用洗涤剂浸泡洗涤。 错流的微滤或超滤系统常使用CIP系统清洗。,4辅助设备的清洗,注意： （1）空气过滤器和液体过滤装置不易清洗干净，必要时需用人工进行清洗。 （2）无论何种热交换设备，若是用于培养基的加热或冷却，换热面上的结垢或焦
5、化是很难避免的，也不易清洗。适当提高介质流速对减少此问题非常有效。,三、CIP清洗系统及设备,所谓CIP系统，是clean in place的简称，意即内部清洗系统。 CIP利用离心泵输送清洁液在物料管道和设备器内进行强制循环，达到清洗目的而不需要对管道设备解体，提高设备利用率减少劳动强度。,CIP清洗系统有多种形式，传统上是一种一次性洗涤系统，即消毒剂只供使用一次即舍去。 一次性使用系统适用于那些贮存寿命短，易变质，不宜重复使用的消毒剂。 它包括一个含有进水孔及水平探针的罐和一台离心泵用以驱动洁净的洗涤剂的循环利用，并设有一喷射口以通入加热蒸汽或添加经计量泵计量的洗涤剂。,CIP清洗系统及设
6、备,洗涤剂一次性使用的CIP系统,1-过滤器 2-循环泵 3-喷射器 4-蒸汽进口 5-排污阀 6-洗涤剂贮罐,若生产设备只用于生产单一产品，洗涤剂可重复利用，不仅节省洗涤剂用量，而且减少排污对环境的污染。 用循环回收水配置初洗涤液，可节省用水。配料罐内有换热蛇管，用以加热洗涤剂，用泵使洗涤剂循环。从贮罐中心取样测量洗涤剂浓度以保证其正常值。需配置中和罐以备加酸中和碱性洗涤剂。,CIP清洗系统及设备,洗涤剂重复利用的CIP系统,1-过滤器 2-循环泵 3-新鲜洗涤剂贮罐 4-回收洗涤剂 5-热水罐 6-回收水贮罐,CIP清洗系统及设备,洗涤剂多次利用的CIP系统,1-过滤器 2-循环泵 3-喷
7、射器 4-混合加热器 5-洗涤剂罐 6-回收水贮罐,该系统包含洗涤剂及水的回收罐，循环泵，过滤器等。 预洗用水使用回收水，用完后可直接排放或贮留一段时间以进行中间洗涤。 洗涤剂可使用混合洗涤剂，如果需要，也可用化学洗涤剂。要确保洗涤温度在预定的范围内。洗涤剂及漂洗用水循环使用一定次数，当其所含的污脏物达到一定浓度后就不宜回收而需排放废弃。,四、清洁程度的确认,1清洁程度的检验清洁程度检验系统和方法包括设备检验、操作检验和成效检验。,2表面清洁规范,无残留固体污赃物或垢层； 在良好光线下无可见污染物，且在潮湿或干燥的状况下，表面均没有明显的气味； 手摸表面，无明显的粗糙或滑溜感； 把白纸印在表面
8、后检查无不正常颜色； 在排干水后表面无残留水迹； 在波长340380nm光线检查表面无荧光物质。,蛋白质污脏物的检测 残留细胞的检验 致热物质的检测 检查最终漂洗结果,第二节 设备及管路的灭菌,蒸汽加热灭菌方法是最普遍的杀菌方法，加热灭菌可把微生物细胞及孢子全部杀死。对于一个优良的蒸汽灭菌系统，加热时间和温度是最重要的两个参数。,表13-3 蒸汽杀菌温度和时间（MRC建议）,实验室的培养基杀菌：121 （0.1MPa表压），15min。 管路的杀菌：121、30min。 较小型的发酵罐： 121、 45min。 大型发酵系统： 121， 1小时。 设备用蒸汽灭菌，通常选择0.150.2MPa的
9、饱和蒸汽，这样即可较快使设备和管路达到所要求的灭菌温度，又使操作较安全。,确保设备的所有部件均能耐受130高温。 要避免死角和缝隙。 所有阀门均应利于清洗、维护和杀菌，最常用的是隔膜阀。 设备的各部分均可分开灭菌，且需有独自的蒸汽进口阀。 管路应能彻底排除冷凝水。,一、发酵罐及容器的灭菌,1发酵罐的灭菌 能承受0.15kPa饱和蒸汽的灭菌。 加热夹套要满足耐压要求，必须有排水排气设计。 罐和容器在使用前必须进行耐压和气密性实验。检查方法是：保持温度不变，检查压强是否恒定，可检查罐的压强是否改变来确定是否存在渗透。检测气压的压力表罐体连接管应尽量短，同时尽可能装置小蒸汽阀以确保灭菌彻底。,发酵罐
10、及容器的杀菌过程,容器的气密性试验，打开所有的冷凝水排除阀，开启进蒸汽阀。,一定压强后，打开排空气阀，把容器中原有的空气排除干净。,当罐内压强升至0.1MPa(121)，计灭菌时间，杀菌过程中不断排除蒸汽管路及罐内的蒸汽冷凝水。,结束灭菌操作时，先关闭所有排污阀及排气阀，然后关蒸汽进口阀，打开无菌空气进口阀，以确保罐内压强。,2容器的排料系统蒸汽杀菌 罐和容器的排料口设在最低点。,图13-4 排料管蒸汽灭菌配置图,罐内通气灭菌过程时，阀门A、C和F开启，阀门B、D和E关闭。此管路配置既可保证罐能正常通气加热杀菌又能使阀门A、B和C经受彻底的通气杀菌，杂菌要侵入，必须经过两个阀座才能进入罐中，这
11、样的配管有利于罐系统的无菌保证。,3罐的CIP清洗系统蒸汽杀菌配管,在蒸汽加热灭菌过程中，阀门B和C打开，阀A关闭，故整套清洗喷洒头装置均可经受彻底的蒸汽加热灭菌过程。,图13-5 CIP系统蒸汽灭菌管路配置,二、空气过滤器的灭菌,过滤器的杀菌主要是采用饱和干蒸汽。,图13-6 发酵罐空气过滤器的加热灭菌配置,图13-7 较理想的空气过滤器加热灭菌配置,图13-8 过滤器单独灭菌的管路配置,三、管路和阀门的灭菌,隔膜阀,隔膜阀蒸汽加热杀菌有3种方法, 蒸汽直接通过阀门，阀门与管路均充满蒸汽，可保证杀菌彻底，这是最佳的方式。 利用隔膜阀上的取样和排污小阀门，通入蒸汽或放出蒸汽冷凝水，使隔膜两边充
12、分灭菌。 是确保阀门接管的盲端管长与管径之比不大于6倍，且必须保证管内不积存冷凝水。这种方法容易发生灭菌不彻底。,保证管道彻底灭菌的设计要求,管道应有一定的斜度，通常取1/100或更大； 凹陷低点安装排污阀； 管路有足够的支撑点； 尽可能减少和简化管路，尽可能少用弯头管件和阀门； 尽可能减少最高与最低点，且在每个最高点装设蒸汽进管，在最低点均装冷水阀； 每个罐及管道尽可能分开灭菌。这样才能保证蒸汽杀菌的严密性与稳定安全性。,灭菌时，关闭阀A和F，依次打开阀E、D、B和C，最后开启蒸汽阀，通入蒸汽灭菌。灭菌结束，先关闭阀E然后关闭阀C，阀F开启以免管路因蒸汽冷凝而产生真空后漏入污染物。,图13-10 两个罐及连接管的蒸汽杀菌,此时便可打开阀A把罐1的培养基压送到罐2。,冷凝水的排放,自由排放 用汽水阀自动排放 利用计算机自动控制排除冷凝水,四、灭菌程度的检验,直接微生物培养法：肉汤培养基（牛肉膏0.5，NaCl0.5，蛋白胨1），培养710天。 杀菌蒸汽的温度和压强监控法 蒸汽温度监控：外壁温度高于115（此时容器内的温度可达121）。 压力表稍高于0.1MPa。,
