1、第六章：基因文库的构建,高燕会,主要内容：,1、 基因组文库 2、 cDNA文库 3、 特殊序列文库 4、 酵母人工染色体（PAC）,基因文库就是随机克隆的集合。,基因文库是通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。通常所说的基因文库包括基因组文库和cDNA文库，两种文库构建的基本程序相同，主 要包括载体的制备、插入片段的制备、载体与插入片段的连接和重组DNA分子导入宿主菌。,根据核酸来源不同：基因文库分为,基因组文库是由一种生物的所有基因组DNA构建而成的。cDNA文库是利用从RNA序列反转录形成的cDNA序列构建的。 此外:特殊序列文库
2、是针对某些特殊基因或序列而建立的。,构建文库所使用的载体主要有： 噬菌体(噬菌斑) 粘粒(菌落) 质粒 酵母人工染色体 (构建高等真核生物基因文库设计),根据所用载体的不同： 质粒文库 噬菌体文库 粘粒文库 YAC文库,质粒文库：其构建过程相对简单，但载体装载外源DNA的长度有限，主要用于原核细胞基因组文库和克隆数不多的cDNA文库的构建。、 粘粒文库和噬菌体文库：其装载容量较大，克隆效率较高，是目前构建基因组文库和cDNA文库最为常用的载体。 YAC载体能够容纳长达1Mb的外源DNA，主要用于超长DNA片段的克隆，,第一节：基因组文库 （Genomic Libraries）,指把某种细胞的整
3、个基因组DNA，按一定长短要求，酶解成若干片段，在与适当的载体分子重组后，引入相应宿主细菌的细胞中，形成一大批含有重组体DNA分子的细胞克隆群体。 即：含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和,建立基因组文库，取决于两项技术系统,一是具有包装能力的载体系统， 二是离体包装系统。,（1）载体系统,具有包装能力的载体系统主要有两类：噬菌体和粘粒,A噬菌体载体,插入型载体，只有一个可供外源DNA插入的酶切位点。 取代型载体，具有两个酶切位点，两个位点之间的DNA片段可以被外源DNA取代。 取代型载体应用最广泛 如 EMBL1-4是一类取代型载体系列,B粘粒,粘粒作为载体的特点是： 一般质粒
4、的特性外还能装载大片段的外源DNA， 有可以识别噬菌体包装的“cos”位点。 包装时，只有能够达到所需片段的分子量标准的重组子才能被装入噬菌体的外壳内，形成有感染能力的颗粒。 然后，经过转导将外源DNA克隆化，达到建库目的。,质粒噬菌体,（2）离体包装系统,A对带有外源DNA的杂合分子有直接筛选和富集的作用。 B提高重组DNA分子产生克隆的频率,离体包装系统由两种具有突变的溶源化的大肠杆菌组成。 溶源化菌株是指具有形成和释放噬菌体的潜在能力的菌株。, 基因组文库的规模N基因组文库克隆总数 P所需机率N= f插入片段与基因组DNA长度之比 建立基因组文库的一般程序1载体DNA片段的制备DNA分离
5、纯化 限制酶切 脱磷酸化反应2 供体DNA片段的制备 总DNA分离纯化 机械剪切法 分离特定大小DNA片段 酶法 部分酶切 分离特定大小DNA片段完全酶切,ln（1-P）,ln（1-f）,3. 供体与载体DNA连接要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分子的克分子比率。 4. 重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化）5. 基因组文库质量的评价1）文库规模-随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。2）重组频率-频
6、率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。,第二节 、cDNA文库,定义：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成 cDNA后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。,1. 基因特异性常来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：15% mRNA，8085% rRNA，1015% tRNA2. 器官特异性不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同,1、cDNA文库的特点,4. 不均匀性在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，
7、尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。5. 各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）,3. 代谢或发育特异性处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同,2、cDNA文库,(1)原理： RNA cDNA 克隆 真核基因：内含子和特定的调控结构 采用构建cDNA文库是为了对某些真核基因进行研究,N = f为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部cDNA (mRNA）分子数目之比,3、cDNA文库的规模,4、建立cDNA文库的一般程序,1. 载体DNA片段的制备2. 多聚（A）RNA的分离与纯化3.
8、 双链cDNA 的合成1）单链cDNA 的合成：反转录法2）第二条cDNA 的合成：碱解或酶解（RNaseH）法除去RNA分子,2）同聚物加尾：可大大减少载体DNA自身连接3） cDNA的定向插入 5. 重组cDNA分子的转移和文库的建立选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为载体，则需进行体外包装、感染等。,4. ds- cDNA与载体DNA 相连1）人工接头：要求具平端ds- cDNA，酶切时可能导致某些cDNA链断裂,cDNA的定向插入,3特殊序列文库,染色体分类库 显微切割法建库,染色体分类库,目的基因被定位与某个特定的染色体上，那么，就可以构建一个关于那条染色体的文库，并可进一步
9、扩增目的基因。 常用的方法是利用荧光激活器分离完整的染色体。使用此种方法时，染色体最好处于中期，此期的染色体处于高度集缩状态，易于操作,显微切割法建库,如果一个基因被定位于一条特定的染色体或染色体上的某个区域，可以采用显微切割法来获取材料。 首先，在光学显微镜下观察被染色的染色体。 然后，用显微镜处理器将整条染色体或某一片段移开，并用移液管收集材料。 最后，用收集到的材料进行建文库。,4酵母人工染色体(YAC),构建高等真核生物基因文库YAC容纳的DNA片段可达106,YAC的组成,端粒(TEL)序列 着丝粒(CEN) 自主复制序列 SUP-4(外源DNA插入失活的选择标记) URA3和TRP
10、1,端粒(TEL)序列：TEL序列贮存有染色体端粒形成的必需的信息。具有防止染色体末端被降解的功能。 着丝粒(CEN)：这一部分的功能是保证染色体向两极运动。它是细胞分裂不可缺少的部分 自主复制序列(ARS)：ARS序列具有复制起始功能，它是插入的DNA片段在酵母细胞中维持独立复制的保证。,SUP-4：这是外源DNA插入失活的选择标记，用于在受体细胞筛选重组克隆。SUP-4中Trp fRNA基因的一个抑制突变，基因内分布有EcoRI和SmaI等酶切位点。当外源片段插入后，抑制基因被破坏，受体细胞形成红色菌落。 URA3和TRP1：URA3和TRP1分别位于外源DNA插入位点两侧的臂上。功能是纠正受体细胞的营养缺陷型，便于转染细胞的筛选。,（2）程序,A 经大肠杆菌扩增后的载体DNA，用BamH I切去载体的填充部分 B 用BamH I或Not I切开克隆位点然后使两臂分别与经部分酶解的DNA大片段两端连接，形成带有外源片段的YAC C 通过转染方式将重组后的YAC导入受体细胞 D筛选：利用互补方式将带有YAC的酵母细胞营养缺陷型筛选出来。,1 什么是基因组文库？ 2 什么是cDNA文库？ 3 用于构建基因文库的载体有几种？各自的特点是什么？ 4 酵母人工染色体由哪几部分组成？各自的功能如何？ 画图说明RNaseH法合成cDNA的过程,
