1、 上海交通大学博士学位论文CD4CD25Foxp3调节T细胞与炎症性肠病疾病活动性的关系研究姓名：孙菁申请学位级别：博士专业：内科学（消化系病）指导教师：袁耀宗20070501上海交通大学医学院博士学位论文CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞与炎症性肠病疾病活动性的关系研究摘要背景与目的：炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD ）是一组病因未明的累及肠道的慢性非特异性炎症，主要有克罗恩病（ CD）与溃疡性结肠炎（UC）两种。目前我国炎症性肠病的发病率正逐渐上升。炎症性肠病主要临床表现为腹痛、腹泻、便血及发热等。炎症性肠病病因及发病机制迄今尚未完全阐明。
2、近年来国外对IBD动物模型研究表明CD4 +CD25+调节性T细胞（Treg）与IBD发病密切相关。本研究试图阐明中国IBD患者外周CD4+CD25+调节性T细胞的表达频率及体外抑制功能的变化和肠粘膜中Treg的表达与IBD疾病活动性的关系。方法：将研究对象分为正常对照组、CD患者组与UC患者组。通过流式细胞术分析外周CD4+CD25+调节性T细胞的表达频率以及其特征性标志Foxp3蛋白的表达，并从Foxp3mRNA 基因水平 进一步证实。应用免疫组织化学及免疫荧光的方法观察IBD患者肠粘膜的Foxp3的表达。在体外，应用 MACS磁珠分选出外周 CD4+CD25+T细胞和CD4+ CD25-
3、T细胞，通过共培养抑制实验3H-胸腺嘧啶掺入法探讨CD4 +CD25+T细胞对自体CD4 +CD25-效应T细胞增殖的抑制能力。应用 ELISA 方法检测细胞培养上清液中的IL-10与IFN- 及外周IL-6 与 IFN-细胞因子的表达水上海交通大学医学院博士学位论文平。结果：（ 1）外周 CD4+T细胞中 CD4+ CD25+T 细胞和CD4+CD25+Foxp3+T细胞的表达频率在CD缓解期显著高于正常对照组，差异有统计学意义（P0.05），CD活动期患者该群细胞表达频率与正常对照组相比差异无统计学意义（P0.05）；而中重度UC患者该群细胞表达频率显著低于正常对照组，差异有统计学意义（P
4、0.05）；Foxp3mRNA的结果与上述一致；（ 2）免疫组织化学及免疫荧光染色均发现IBD患者的肠粘膜Foxp3+T细胞的浸润较正常对照组显著增高（P0.05）；（3）体外抑制功能试验提示CD活动期与中重度UC患者的Treg抑制功能减弱，与正常对照组相比差异有统计学意义（P0.05）；（4）细胞培养上清液中IL-10与IFN- 细胞因子IBD组与正常对照组未见显著差别；（5）IBD患者外周IL-6与IFN-细胞因子表达水平增高，与正常对照组相比差异有统计学意义（P0.05）。结论：CD 活动期患者的外周CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达频率与正常对照组相比未见显著变化，但其Tre
5、g体外免疫抑制功能明 显下降；而UC中重度患者不仅外周CD4+CD25+Foxp3+T细胞的表达频率明显下降，并且Treg的体外免疫抑制功能也明 显受损。因此， IBD患者外周CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量与功能异常与IBD 的疾病活动度密切相关。关键词：CD4+CD25+ 调节性T细胞，Foxp3，克罗恩病，溃疡性结肠炎上海交通大学医学院博士学位论文ASSOCIATION OF CD4+CD25+FOXP3+ REGULATORY T CELLS WITH THE DISEASE ACTIVITY OF INFLAMMATORY BOWEL DISEASE ABSTRACTBAC
6、KGROUD & AIMS: Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammatory condition of the gastrointestinal tract that manifests as 2 distinct but sometimes overlapping clinical entities, Crohns disease (CD) and ulcerative colitis (UC). The etiology and pathogenesis of IBD is still poorly understood
7、. The incidence of IBD in mainland China is gradually increasing in recent years. The clinical manifestations of IBD include abdominal pain, diarrhea or bloody diarrhoea associated with fever. Recent researches showed some evidence suggesting that CD4+CD25+ regulatory T cells (Treg) played a crucial
8、 role in the development of IBD in animal models. The aim of this study was to determine the correlation between the disease activity of IBD and the frequency and inhibitory effect of Treg cells as well as their distribution in the intestinal mucosa. 上海交通大学医学院博士学位论文METHODS：Patients with CD or UC wer
9、e recruited from department of gastroenterology, Ruijin Hospital in comparison with a group of randomly selected control subjects. Treg cells were collected from peripheral blood and from biopsy specimens of all subjects. Using flow cytometry (CD4+CD25+, CD4+CD25+Foxp3+), immunochemistry, immuno-flu
10、orescence analysis (Foxp3) and real time PCR (Foxp3), regulatory T cells were identified by their expression of CD4, CD25 and their unique marker Foxp3. In vitro, CD4+CD25+ T cells were separated from CD4+CD25- effector cells in a MACS magnetic field. The inhibitory effect of CD4+CD25+ T cells was d
11、etermined by their suppressive effect on the proliferation of CD4+CD25-effector T cells. RESULTS: To the best of our knowledge, this was the first study that compares the frequency of CD4+CD25+ Treg cells in active IBD with inactive IBD. (1) It appears that there is statistically significant increas
12、e in the frequency of CD4+CD25+ Treg cells & CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells in peripheral blood of inactive CD subjects (P0.05) in comparison to controls, whereas such difference is not apparent in subjects with active CD. On the other hand, the number of Treg cells was significantly reduced in subjects
13、 with moderate-severe UC (P 0.05). These results were confirmed by measurement of Foxp3 transcripts by real time PCR. (2) On the mucosal 上海交通大学医学院博士学位论文level, Foxp3+ T cells were found to accumulate in the intestinal mucosa biopsy tissue of active IBD patients as opposed to controls. (3) In vitro, C
14、D4+CD25+ T cells derived from patients with active IBD displayed reduced inhibitory activity towards CD4+CD25- effector T cells. Similar results were found in subjects with mod-severe UC. (4) There was no significant difference between the culture supernatant concentration of IL-10 and IFN-. (5) The
15、 plasma concentration of IL-6 and IFN- are significantly higher in patients with either CD or UC than in the controls. CONCLUSIONS: CD4+CD25+Foxp3+Treg are present in similar frequency in active CD patients and healthy controls. However, the inhibitory effects of these Treg cells were significantly
16、reduced in subjects with active CD. Moreover, in patients with mod-severe UC, both the frequency and inhibitory effects of such Treg cells were severely impaired. These findings might have important implication in the understanding of the role of CD4+CD25+Treg cells in the pathogenesis of IBD. KEY W
17、ORDS: CD4+CD25+ regulatory T cells, transcriptions factor Foxp3, Crohns disease, ulcerative colitis 上海交通大学医学院博士学位论文缩略词表英文缩写 英文全称 中文全称CD4+CD25+ TregIBDCD4+CD25+ regulatory T cellInflammatory bowel diseaseCrohns diseaseCD4+CD25+调节性T细胞炎症性肠病CD 克罗恩病UC Ulcerative colitis 溃疡性结肠炎免疫磁性分离外周血单个核淋巴细胞叉状头/翅膀状螺旋转录因
18、子酶联免疫吸附实验-干扰素MACSPBMCsFoxp3ELISAIFN-IL-10IL-6Magnetic activated cell sortingPeripheral blood monocytic lymphocyteForkhead/winged helix transcription factorEnzyme-linked immunosorbentassayInterferon-Interleukin-10 白细胞介素-10白细胞介素-6异硫氰酸荧光素藻红蛋白Interleukin-6FITC Fluorescein isothiocyanatePhycoerythrinPEAP
19、C Allophycocyanin 别藻蓝素cDNAEDTAFBSComplementary DNA 互补 DNAEthylene Diamine Tetraacetic AcidFetal Bovine Serum乙二胺四乙酸胎牛血清rpm Revolutions per minutePhosphate Buffered SalinePolymerase Chain Rection-Mercaptoethanol转/分钟PBS 磷酸盐缓冲液聚合酶链反应-巯基乙醇PCR-MEIII上海交通大学医学院博士学位论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，
20、独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期： 年 月 日上海交通大学医学院博士学位论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密，在
21、 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日上海交通大学医学院博士学位论文前言炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是一组病因未明的累及肠道的慢性非特异性的肠道炎症，包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC ）和克罗恩病（Crohns disease, CD）。IBD在欧美国家，尤其是北美的 发病率较高。在北美，UC和CD的发病率分别为 2.2-14.3/10万人/年和 3.1-14.6/10万人/ 年，患病率为 37-246/
22、10万人和 26-199/10万人。每年在欧洲有 50,000-68,000人诊断为UC，23,000-41,000人诊断为CD。IBD的主要临床表现有腹痛、腹泻、便血及发热等，严重影响患者身体健康。随着我国经济的不断发展，人民生活方式的逐年改变、疾病谱的变化以及医务工作者对IBD的不断深入认识，中国报道的 IBD发病率正逐年上升，目前国内尚缺乏大规模以人口为基础的流行病学调查，但粗略推测我国的CD患病率为1.4/10 5人1，UC患病率为 11.6/105人2。一项基于住院患者的回顾性研究显示我国IBD住院患者呈逐年上升趋势，2003年UC住院例数和内镜检 出率分别是 1990年的 3.4倍
23、和4.1倍；2003年住院总患者中CD患者的构成比为 1990年的 2.8倍1 。IBD对人民群众的健康造成严重影响，并给社会医疗支出带来极大负担。由于对 IBD的病因和发病机制缺乏全面深入的认识 ，目前内科治疗活动期 IBD的主要药物仍为一些阻断或封闭炎症级联反应的药物如氨基水杨酸类药物、激素与免疫抑制剂等，疗效并不尽如人意，仅能部分缓解患者症状，而无法彻底治愈该病。因此，尽快阐明 IBD的发病机制以探索新的治疗靶点，改善疾病的 预后是临床亟待解决的问题。然而，阐明 IBD的发病机制是目前全球医学界所面 临的难题。随着对 IBD 发病机制研究的深入，人们发现 IBD的发病与一系列局部免疫异常
24、有关。 IBD患者肠黏膜固有层中有大量淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润并伴有局部体液或细胞免疫激活，且 IBD患者可伴发其他免疫相关性疾病并 对激素和免疫抑制剂等治疗有效1上海交通大学医学院博士学位论文等现象均提示异常免疫反应参与了 IBD发病。因而近年来，人 们愈发认识到 IBD是一种免疫功能失衡性疾病。因此积极寻找 IBD的免疫学 发病机制对指导 IBD 的临床治疗和探索新的免疫靶位治疗具有非常重要的临床意义。免疫反应受到特定的免疫调节细胞调控，而调节性 T细胞（regulatory T cells ，Treg）这群可以阻止损伤 性免疫病理发生的 T淋巴细胞引起了学者极大的关注。调节性 T
25、细胞是机体以“主动”的方式维持自身稳定的主要途径，抑制免疫反 应，体外增殖能力低，主要作用于免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡状态。正常人和小鼠的外周血和脾脏组织的CD4+ CD25+Treg约占CD4+T 细胞的 5-10，这群细胞持续高表达CD25分子（IL-2R链）。 这群细胞被认为在先天性和后天性免疫系统的外周调节中起特殊作用。CD4+ CD25+Treg具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特征。免疫无能性表现为对高浓度IL-2的单独刺激、固相包被或可溶性抗CD3单抗、以及抗CD3单抗和抗CD28单抗的联合作用呈无应答状态，也不分泌IL-2。CD4 +CD25+Tr
26、eg的免疫抑制特性表现在其经过TCR 介导的信号和辅助信号刺激而后活化，能够抑制CD4+ 和CD8+细胞的活化和增殖。TCR 介导的信号可以是抗CD3单抗的刺激，也可以是抗原特异性刺激，但是 CD4+CD25+Treg一旦被活化，其发挥抑制作用则是非抗原特异性的，该免疫抑制作用不具有MHC的限制性，能够抑制同种同型T细胞以及同种异型T细胞的增殖。发现Treg的重要意义在于它是 维护正常免疫耐受的最重要的机制之一。 Treg数量与功能变化和许多与免疫相关疾病的发生、发展有关，而调节或修饰Treg将会具有令人振奋的临床治疗前景3。CD4+CD25+Treg已被证实 与多种自身免疫性疾病的发生有关。
27、对易感个体而言，环境因素和基因异常会影响CD4+ CD25+Treg在胸腺中的发育以及在外周的增殖和自稳，并改变其免疫调节活性，从而使自身免疫性疾病易于发生。一项对 27例类风湿关节炎患者的研究4显示：患者外周血中CD4 +CD25+Treg细胞百分比与正常健康者相似，而炎性关节腔滑液中Treg 细胞数量较 外周血中明显增加。关节腔滑液中的Treg细胞能显著抑制效 应细胞，并能抑制同一个体外周血的效 应细胞。这是第2上海交通大学医学院博士学位论文一个证实自身免疫性疾病患者的靶器官中Treg 细胞增加并能抑制自体效 应细胞增殖的研究。在I型糖尿病5 与多发性硬化症6 患者中同 样也发现CD4 +
28、CD25+Treg的免疫抑制功能降低，而其数量没有明显改变。CD4+CD25+Treg对机体有利害两方面的作用，一方面，CD4+CD25+Treg可阻止自身免疫性疾病、炎症反应、变态反应和移植耐受的发生；另一方面，由于CD4+CD25+Treg抑制了特异性 T细胞反应，对肿瘤、免疫缺陷及病毒感染等疾病产生消极的作用。因此CD4+ CD25+Treg对免疫系统的双重作用值得我们深入研究，尤其对那些目前人类人无法攻克的疾病更具有潜在价值。基于CD4+CD25+Treg对免疫系 统特殊的调节功能，因此近年来有学者开始探索其与IBD发病之间的关系。 Maul7等的研究发现 IBD患者外周血中 CD4+
29、CD25+Treg在疾病活动期时数量减少，而在疾病缓解期时数量增加，但其仍保持对效应细胞的抑制功能。亚洲国家IBD发病率和临床表现等均与西方国家存在 较大差异，因此有必要进一步探索中国IBD患者的发病机制，为探索新的治 疗方法提供理论基础。目前国内尚未见CD4+CD25+Treg 的表达与IBD疾病活动性的关系研究报道，因此本研究是试图阐明CD4+CD25+Treg 在中国IBD患者发病中作用的研究，并对其效应机制进行初步探索。研究Treg 与中国IBD患者发病之间的关系将为深入理解IBD的发病机制提供了一个新方向，为其治疗手段提供新思路，具有潜在的社会效益与经济效益。3上海交通大学医学院博士
30、学位论文第一部分炎症性肠病患者外周血CD4+ CD25+Treg的检测引言在对 IBD免疫学发病机制的研究中，一群可阻止损伤 性免疫病理发生的 T 淋巴细胞引起学者极大关注。早在 20世纪 70年代国外已广泛开展对具有免疫抑制作用的 T细胞的研究，发现机体存在具有免疫抑制作用的 T细胞，是维持外周免疫耐受的重要因素，但因多年来一直缺乏明确的细胞表面标志，因此对体内是否存在以免疫抑制作用为主要功能的 T细胞亚群存有争议。1995年，Sakaguchi等首次发现将去除CD4 +CD25+成分的T细胞转移到裸鼠体内会引发多种自身免疫性疾病，但若将去除的 CD4+CD25 +T细胞群重新回输至裸鼠体内
31、则可预防自身免疫性疾病发生。体外试验也发现 CD4+CD25 +T细胞具有免疫抑制功能，因此Sakaguchi等提出了具有独特作用方式和功能特征的CD4+CD25+T细胞是具有免疫调节作用的细胞群，并将其定义为调节性T细胞。IBD 患者自身免疫耐受发生异常，而调节性T细胞正是机体以“主动”的方式 维持自身稳定的主要途径，能抑制免疫反应，体外增殖能力低，主要作用于免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡状态。目前国内尚未见对 CD4+ CD25+调节性T细胞的表达与IBD患者发病机制间的临床研究，而CD4+CD25+调节性T细胞作为一种重要的有免疫调节作用的T淋巴细胞，在中国IB
32、D患者其疾病的发生、发展以及预后中所起的作用与地位如何，是 值得研究的问题。本实验通过流式细胞术分析IBD患者外周血 单个核淋巴细胞（PBMCs ）与CD4+T细胞中CD4+CD25+ 调节性T 细胞的表达频率，同时与正常对照组相比，探讨CD4+CD25+调节性T细胞与IBD疾病活动性的关系，为进一步分析 CD4+CD25+调节性T细胞的功能提供临床数据支持，为今后的IBD免疫治疗提供重要的基础理论依据。4上海交通大学医学院博士学位论文材料与方法1研究对象1.1炎症性肠病的诊断及评分标准所有入选的IBD患者均来自 2006年 3月至 2006年 12月间瑞金医院消化内科门诊及住院的克罗恩病（C
33、D）和溃疡性结肠炎（UC）患者。IBD 患者均经内镜或病理证实。UC患者根据Truelove and Witts评分标准8（见表 1）分为轻度、中度及重度。CD患者根据Crohns Disease Activity Index（CDAI，克罗恩病疾病活动性指数）评分标准9（见表 2）进行评分，评分150分患者诊断为活动期，而150分者则为缓解期患者。正常对照组来自瑞金医院职工或研究生。表 1 Truelove and Witts 溃疡性结肠炎疾病活动度评分Table 1 Truelove and Witts for Assessing Disease Activity in Ulcerativ
34、e Colitis评分指标每日排便次数便血轻度 中度 重度5次 5次大量少量体温 37.5C90次/min30mm/h10g/dl介于轻度与 37.5 C重度之间 90次/min30mm/h脉搏红细胞沉降率血红蛋白 10g/dl5上海交通大学医学院博士学位论文表 2 克罗恩病疾病活动度评分Table 2 Crohns Disease Activity Index (CDAI)1-每周排 软便或水样便次数之和2分2-腹痛： 0=无，1=轻，2=中，3= 重每周 7天腹痛评分之和5分3-整体感 觉：0=好，1=轻微不适，2=不适，3= 非常不适，4=极为不适每周 7天整体感觉评分之和7分4-与疾病
35、相关表现：每出现一种表现加 20分（1）关节炎、关节痛（2）虹膜炎、葡萄膜炎（3）皮肤病变（结节性红斑、坏疽性脓皮病、口腔溃疡）（4）肛周病变（肛裂、肛瘘、肛周或直肠周围脓肿）（5）其他瘘管形成（6）1周持续发热38 C5-是否使用阿片类止泻药若是，加 30分6-腹块 ：0=无；2=可疑；5=存在根据以上评分10分7-红细 胞压积：正常值：男性=47mm/h 女性=42mm/h（正常值-检测值）6分8-体重 变化100（标准体重-实际体重）/标准体重将以上 8项指标评分相加，得到 CDAI评分CDAI150分：缓解期； CDAI150分：活动期1.2临床分组将研究对象共分 3组，CD患者组，U
36、C患者组与正常对照组。本次研究共入组6上海交通大学医学院博士学位论文CD患者 56例，CD患者组年龄为 14-57岁（平均年龄为 34.011.3岁），其中男性33例，女性 23例。UC患者 26例，年龄为 20-53岁（平均年龄为 39.2 12.2岁），其中男性 18例，女性 8例。另设 20例对照组，为正常志愿者，均为本院职工或研究生，年龄 25-45 岁（平均年龄为 36.84.2 岁），排便习惯正常，无发热、腹痛、腹泻、便秘及便血等症状，排除肠道器质性疾病；排除全身系统性疾病及免疫相关性疾病。2主要实验试剂2.1主要试剂青/链霉素 生物工程公司胎牛血清（FBS） GIBCO人淋巴细胞
37、分离液（1.077）细胞培养液 RPMI 1640APC标记抗人 CD4抗体FITC标记 抗人 CD25 抗体APC标记小鼠 IgG1 同型对照FITC标记 小鼠 IgG2a同型对照Flow Cytometry Staining BufferAXIS-SHIELDGIBCOBECKMAN COULTERBECKMAN COULTERBECKMAN COULTERBECKMAN COULTEReBioscience2.2溶液的配置配置溶液所用试剂购自上海化学试剂公司7上海交通大学医学院博士学位论文2.2.1磷酸缓冲盐溶液（1PBS）：由本实验室自行配制NaCl 8g用 800ml 双蒸馏水溶解后
38、，以 HCl调节溶液 pH值至 7.4，加水至 1L。高压蒸汽灭菌20min后保存于室温。KCl 2gNa2HPO4KH2PO41.44g0.24g2.2.2红细胞裂解液：由本实验室自行配制NH4Cl 4.145g0.5g 加双蒸馏水至 500ml 后以 1N HCl调节 pH至 7.2-7.4。保存于室温。KHCO3Na2EDTA 18.6mg2.3主要实验耗材15ml、50ml离心管Eppendorf管BD FalconAXYGEN2.4主要实验仪器超净工作台 Heraeus普通冰箱 Haier低温台式离心机台式离心机HeraeusEppendorfSartoriusOlympusICEM
39、ATICMiliporeBP2100S型电 子天平普通光学显微镜制冰机超纯水生成仪微量加样器 EppendorfBecton Dickison流式细胞仪 FACS Calibur8上海交通大学医学院博士学位论文3实验方法3.1外周血单个核淋巴细胞（PBMCs）的制备及计数3.1.1外周血单个核淋巴细胞（PBMCs）的制备（1） 取肝素抗凝血 5ml，以 RPMI 1640液等体积稀释（2） 15ml离心管中加入 5ml人淋巴细胞分离液后，用滴管将稀释后的抗凝血缓慢沿管壁滴入管中，叠加于分层液面上。注意保持界面完整性（3） 离心，2500rpm20min（4） 离心后，小心吸出管中间层的云雾状细
40、胞，此即为外周血单个核淋巴细胞，将细胞移入另一管中，加入足量 RPMI 1640 液，充分混匀后，离心，2000rpm10min（5） 弃上清，再次加入足量 RPMI 1640 液，充分混匀后离心，2000rpm10min（6） 弃上清，配成细胞悬液进行细胞计数。3.1.2外周血单个核淋巴细胞的计数将盖玻片盖于细胞计数板的计数区上，将外周血单个核淋巴细胞悬液吹打均匀后，吸取 10l 细胞悬液与 90 l 红细胞裂解液混匀，用微量加样器吸取适量细胞悬液，沿盖玻片边缘轻轻加入。在光学显微镜下进行计数。计数计数区四角的四个大方格中的细胞数，若细胞压线，则只计上线和左线的细胞。细胞数按如下公式计算：（
41、四个大格细胞总数/4）10410（稀释倍数）=细胞数/ml3.2细胞表面染色（1） 分离外周血单个核淋巴细胞（PBMCs）（2） 每管中分别加入 1106个PMBCs细胞，加入PBS溶液 2ml离心，1500rpm9上海交通大学医学院博士学位论文10min，共洗涤 2次（3） 加入 PBS溶液配成 100l细胞悬液（4） 每管分别加入 APC标记抗人 CD4 抗体、FITC标记抗人 CD25 抗体和同型对照抗体（抗体加入量参照说明书建议的最佳标记量调整），避光，4孵育 30min（5） 以 PBS溶液 2ml 离心，1500rpm10min，共洗涤 2次（6） 加入流式细胞 staining缓
42、冲液后，上机检测 CD4和 CD25的表达。3.3流式细胞仪检测应用流式细胞仪检测外周血单个核淋巴细胞表面的各种荧光素的荧光强度，用空白对照和阴性对照消除自发荧光和非特异荧光。Gate圈出拟测定的淋巴细胞群，每次分析 30000个细胞。荧光强度以二维List Mold表格的形式储存于电子计算机中。根据设定的CD4与CD25单抗分析结合该单抗的阳性细胞数及百分比，在 APC-CD4/FITC-CD25的双参数图上得到CD4 CD25 T细胞的比例。3.4统计学分析研究数据应用 SPSS在计算机上分析，在方差齐次的条件下，各组间的两两比较采用 LSD法进行方差分析，Clarence ，若 P0.0
43、5，则认为差异有统计学意义。10上海交通大学医学院博士学位论文结果4 IBD患者的 临床特征本研究共入组 IBD患者 82例。CD患者 56例，年龄为 14-57岁（平均年龄为34.011.3岁），其中男性 33例，女性 23例。根据 CDAI评分标准，56例 CD患者中 14例为缓解期患者，42例为活动期患者。UC患者 26例，年龄为 20-53 岁（平均年龄为 39.212.2岁），其中男性 18例，女性 8例。根据 Truelove and Witts评分标准 UC患者组中轻度患者为 14例，中度为 7 例，重度患者为 5例。另设 20例正常对照组，均为本院职工或研究生，年龄 25-45
44、 岁（平均年龄为 36.84.2 岁），男性 10例，女性 10例。正常对照者排便习惯正常，无发热、腹痛、腹泻、便秘及便血等症状，排除肠道器质性疾病；排除全身系统性疾病及免疫相关性疾病。IBD 患者组和正常对照组基本临床特征见表 3。表 3 IBD患者组和正常对照组的基本临床特征Table 3 Baseline clinical characteristics of IBD patients and healthy controls项目例数IBD82CD56UC26正常对照组2035.112.2（14-57 ）51/3134.011.3（14-57 ）33/2339.212.2（20-53 ）
45、18/836.84.2（25-45 ）10/10年龄（岁， x s）性别（男/女）体重（kg， x s）病程（月）50.54.340.26.249.5 3.836.55.952.65.248.36.461.22.8-11上海交通大学医学院博士学位论文5 FACS检测CD4+CD25+T细胞表达频率与IBD疾病活动性关系分析2.1 IBD患者外周血CD4+ T细胞中CD4+CD25 +T细胞表达频率2.1.1 CD患者外周血CD4+T细胞中CD4+ CD25+T细胞表达频率我们通过流式细胞术检测 CD患者组与正常对照者外周血 CD4+CD25+T细胞的表达频率。结果发现，正常对照组、活动期CD患
46、者和 缓解期CD 患者外周血CD4+T细胞中CD4+CD25+T细胞比例分别为 5.163.97、5.151.81和 7.532.32。缓解期CD患者外周CD4+ T细胞中的CD4+CD25+T 细胞比例显著高于正常对照组与活动期CD患者组，差异有统计学意义（P0.05），活动期CD患者该群细胞比例与正常对照组相比差异无统计学意义（P0.05 ）（见表 4，图 1）。表 4 CD患者组与正常对照组CD4+ T细胞中CD4+CD25+T 细胞频率比较（ x sTable 4 Comparison of the frequency of CD4+CD25+ regulatory T cells i
47、n CD4+ T cellsin CD patients and healthy controls ( x s）)CD4+T细胞中CD4+CD25+T细胞比例（）5.163.97组别 例数正常对照组 204214活动期组缓解期组5.151.81#CD患者组7.532.32*#：与正常对照组相比，P0.05*：分别与正常对照组和活动期组相比，P0.052.1.2 UC患者外周血CD4+T细胞中CD4+ CD25+T细胞频率外周血CD4+T细胞中CD4+CD25+ T细胞频率在正常对照组和UC患者轻度、中重度患者组中分别为 5.16%3.97%、5.12%2.32%、4.45%2.96%。轻度UC
48、 患者该群细胞比例与正常对照组相比差异无统计学意义，而中重度UC患者组外周血CD4 +T细胞中的CD4+CD25+T细胞比例低于正常对照组和UC轻度组，两组相比差异有统计学意义（P0.05）（见表 5，图 1）。12上海交通大学医学院博士学位论文表 5 UC患者组与正常对照组CD4+ T细胞中CD4+CD25+T 细胞频率比较（ x s）Table 5 Comparison of the frequency of CD4+CD25+ regulatory T cells in CD4+ T cellsin UC patients and healthy controls( x s)CD4 T细
49、胞中组别 例数 CD4 CD25 T细胞频率（）正常对照组 2014125.163.975.122.32#4.452.96*轻度组UC患者组中、重度组#：与正常对照组相比，P0.05*：与正常对照组和UC轻度组相比，P0.05109876543210*P0.05组 别图 1 IBD患者组与正常对照组 CD4+T细胞中CD4+CD25+T细胞频率比较Figure 1 Comparison of the frequency of CD4+CD25+ regulatory T cells in CD4+ T cells in IBDpatients and healthy controls13上海交通大学医学院博士学位论文2.2 IBD患者外周血单个核淋巴细胞中CD4+CD25+T细胞表达频率2.2.1 CD患者外周血单个核淋巴细胞中C
