1、济源市疾病预防控制中心 文件编号：第 1 页 共 1 页 第 1 版 第 1 次修订作业指导书起草人：王军鹏 审核人： 批准人： 批准日期：2013 年 12 月 18 日标题：MDCK 细胞冻存标准操作规程 实施日期：2013 年 12 月 18 日1. 范围适用于实验室所有技术人员进行 MDCK 细胞的冻存操作。2. MDCK 细胞冻存程序 2.1 生物安全要求 MDCK 细胞培冻存实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在 BSL-2 实验室的生物安全柜里进行。 2.2 材料 2.2.1 生长成片的 MDCK 细胞：8090成片，细胞生长良好存活率高2.2.2 二甲基亚砜（DMSO
2、） 2.2.3 胎牛血清2.2.4 EDTA-胰酶(0.05胰酶；0.53mMEDTA4Na) 2.2.5 无菌移液管：1mL 和 10mL 2.2.6 15mL 无菌离心管注意事项：经常检查试剂使用的有效期。 2.3 实验步骤 2.3.1 冻存液的制备：胎牛血清 9mL；二甲基亚砜 1mL。2.3.2 细胞消化：2.3.2.1 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入 5mL 在 37水浴中预热的 EDTA-胰酶。2.3.2.2 温和地摇动细胞瓶 1min，使 EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去 EDTA 胰酶。 2.3.2.3 重新加入 5mL 在 37水浴中预热的 EDT
3、A-胰酶重复上述步骤。2.3.2.4 加入 1mL EDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约 510min） 。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入 1mL 胎牛血清灭活残余的胰酶。2.3.2.5 加 9mL 已经配置好的含有 L-谷氨酸的 D-MEM 培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。2.3.3 细胞消化后，移入 15mL 离心管，1000rpm，离心 5min，弃上清，轻弹离心管底，重悬细胞，加入配制好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内。细胞冻存浓度为1106/mL 细胞。2.3.4 常规细胞冻存过程：42h，-202h，放入液氮长期保存。如使用商品化冻存盒，直接放于-80过夜，第二天从冻存盒取出，放入液氮保存。3说明3.1 整个试验过程要防止 MDCK 细胞污染。4.技术依据WS285-2008流行性感冒诊断标准 附录 A、B 。
