1、济源市疾病预防控制中心 文件编号：第 1 页 共 2 页 第 1 版 第 1 次修订作业指导书起草人：王军鹏 审核人： 批准人： 批准日期：2013 年 12 月 18 日标题：MDCK 细胞传代标准操作规程 实施日期：2013 年 12 月 18 日1. 范围适用于实验室所有技术人员进行 MDCK 细胞培养和传代操作。2. MDCK 细胞培养和传代程序 2.1 生物安全要求 MDCK 细胞培养和传代实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在 BSL-2 实验室的生物安全柜里进行。 2.2 材料 2.2.1 生长成片的 MDCK 细胞 2.2.2 无菌的 T25/T75 细胞培养瓶 2.
2、2.3 D-MEM 培养液（含有 L-谷氨酰胺） 2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL 青霉素 G；10000g/mL 硫酸链霉素） ，分装后保存于-20 2.2.5 HEPES 缓冲液，1M 母液 2.2.6 胎牛血清 2.2.7 EDTA-胰酶（ 0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na） ，分装后保存于 -20 2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分 V 2.2.9 1mL、10mL 无菌移液管 2.2.10 7075的酒精 注意事项：经常检查试剂使用的有效期和 MDCK 细胞的代数。 2.3 实验步骤 这里以 T25 细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述 MDCK 细胞的培养
3、程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK 细胞悬液的量必须做相应的调整。 2.3.1 D-MEM 培养液的准备 500mL D-MEM 液中加入：a）青、链霉素母液 5mL（终浓度达：100U/mL 青霉素； 100g/mL 链霉素） 。 b）7.5%牛血清白蛋白组分 12.5mL（终浓度：0.2%） 。c）HEPES 缓冲液 12.5mL（终浓度：25mM） 。2.3.2 细胞生长液的准备 胎牛血清 10mL 加到 90mL 的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为 10%。2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入 5mL 在 37水浴中预热的 EDTA-胰酶。 2.3.4 温和地摇动
4、细胞瓶 1min，使 EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去 EDTA 胰酶。 2.3.5 重新加入 5mL 在 37水浴中预热的 EDTA-胰酶重复上述步骤。2.3.6 加入 1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约 510min） 。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入济源市疾病预防控制中心 文件编号：第 1 页 共 2 页 第 1 版 第 1 次修订作业指导书起草人：王军鹏 审核人： 批准人： 批准日期：2013 年 12 月 18 日标题：MDCK 细胞传代标准操作规程 实施日期：2013 年 12 月 18
5、日1mL 胎牛血清灭活残余的胰酶。 2.3.7 加 9mL 已经配置好的含有 L-谷氨酸的 D-MEM 培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。 2.3.8 取 10mL 混合物加到 90mL 细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含 105 细胞） 。2.3.9 每个 T25 细胞培养瓶加入 6mL（6105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75 细胞瓶用于细胞传代。通常 6mL 细胞悬液 23 日可生长成片（8090）的单层细胞。 2.3.10 于 37，5%CO2 培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。注：细胞传代的比例可根据细胞生长状况和实验需要进行调节。消化液除
6、 EDTA-胰酶外，也可以用 0.25胰酶与 Versene 按照 1:7 的比例配成消化液使用。3. 质量控制MDCK 细胞随着传代次数的增加，可能会降低其对流感病毒的敏感性。因此实验室应保持低代数的细胞株在液氮中。为了保持该分离系统的敏感性，当细胞复苏后被连续传1520 代，或总代数达到 40 代以上时，可以用已知滴度的阳性质控病毒来检验 MDCK 细胞系的敏感性。如果细胞的敏感性已经下降，即应复苏新的细胞株。所用细胞系应确保无支原体污染。4. MDCK 细胞系的敏感性的检测选择已知 TCID50的流感病毒，在同一条件下分别感染早代（小于 30 代）的细胞株和现有的细胞株，对其进行 TCID50测定。如果测试的 TCID50比早代的低 2 个或以上 Lg，表明其对病毒的敏感性已下降，不应继续使用；如果两者相差不超出一个 Lg，表明可继续使用。5说明5.1 整个试验过程要防止 MDCK 细胞污染。5.2 保持 MDCK 细胞的敏感性。6.技术依据WS285-2008流行性感冒诊断标准 附录 A、B 。
