1、1脑部研究 895（2001 ）253-257抗药性蛋白质在大鼠耳蜗内血内耳屏障中的作用探讨作者：Takehisa Saito*, 张志坚, Masaharu Tokuriki, Toshio Ohtsubo, Ichiro Noda,Yoshiyuki Shibamori, Takehito Yamamoto, Hitoshi Saito耳鼻喉科学部， 福冈医学院，松山郊区，福冈 910-1193，日本收录于 2000 年 12 月 19 日摘要：人类抗药性蛋白 1 的实验结果根据在老鼠的耳蜗中使用逆转录和免疫组织化学法使单株抗体人体多药抗性蛋白反应产生放大得知。对大鼠脑部和耳蜗细胞中的抗药
2、性蛋白基因使用特定的物质产生可预期的 394 副遗传片段。从免疫组织化学上讲，抗药性蛋白在脉络膜组织从，血管纹，螺旋韧带，螺旋凸和耳蜗轴中的耳蜗神经得以发现。从结果看，人类抗药性蛋白在老鼠耳蜗中实验显示，这种蛋白可以像挤压泵一样运行并且在血内耳屏障功能上发挥重要作用。关键词： 人类抗药性蛋白；血内耳屏障；耳蜗；逆转录；免疫组织化学2血内耳屏障在维护内耳系统流体的内稳定性和保护内耳完整性方面发挥着重要的作用。血内耳屏障控制着两种主要功能；防止杂物流入内耳和促进有毒有害物质从内耳排出。作为防止大分子流入的屏障，抗药性蛋白在保证毛细血管内邻近的内皮细胞紧密联系上发挥了重要的作用。做为一个挤压泵，糖蛋
3、白在我们早前的观察中在内耳毛细血管的内皮细胞里的被发现。此外，从药物逻辑学和功能研究上看，这被证明的：糖蛋白从内耳驱逐外源性物质和防止听力混乱。糖蛋白停留在内皮细胞的顶部和细胞腔的表面，针对有害物质从内耳组织渗透进入血液设置从上而下的流体屏障。然而，基侧转运蛋白在内耳存在还有待于进一步确认。大家都知道，很多抗药性蛋白质膜被全部投入完成挤压泵的工作。糖蛋白最初被检测到是作为癌症治疗使用中人类多药抗性蛋白的中介物。此外，糖蛋白在脑毛细血管的内皮细胞中被发现以来，被检测在血脑屏障中发挥着重要的作用。另外一个挤压泵是多药耐药相关蛋白。在大脑中，多药耐药相关蛋白被发现在脉络丛的上皮细胞中。多药耐药蛋白停
4、留在细胞的基底外侧，并且构筑了一道从上而下的阻碍药物渗透的流体屏障。就血脑屏障和血内耳屏障的相似性而言，多药耐药性蛋白若可以在内耳中发挥作用是非常吸引人的。本试验使用逆转录和免疫组织化学的技术评估人类多药耐药性蛋白在老鼠耳蜗的药理作用。3使用七个月大的雄性美国大鼠。最大限度的降低动物承受的的痛苦，减少实验动物的数量和利用替代物品替换活体实验，如果可行。通过在大鼠腹膜内注射戊巴比妥钠达到麻醉(50mg/kg) 所有的核糖核酸使用肝素抗凝的方法在显微解剖下从8只大鼠的耳蜗细胞组织和耳蜗神经中提取，使用试剂盒(品牌：GIBCO BRL,USA)。使用 RNA安培基因 组件扩增器从核糖核酸中通过反转录
5、得到单线互补脱氧核糖核酸（CDNA）。作为实验结果的互补DNA信息在聚合酶链反应中放大得到。最初标本按照原先发布的信使核糖核酸（MRNA）序列设计（基因银行收录编号 X96394）。标本正面（CTGGCTTGGTGTGAACTGAT）和标 本背面（AGGCTCTGGCTTGGCTCTAT）相互对照，大鼠多药耐药性蛋白质的核苷酸序列313-332和706-687。这套标本预期发生聚合酶链反应产生394副简单的结果。聚合酶链反应放大在95度、56度和72度的条件下各反应一分钟总共通过35个周期。聚合酶链反应实验的反应物通过电泳法在1%的琼脂糖胶中分离，并通过核酸染色的方法使其更加形象化。大鼠的脑组
6、织作为积极控制得以作为实验使用。作为消极控制，耳蜗组织的RNA的在不使用逆转录酶的条件下进行反转录。为了进一步确认预期的聚合酶链反应产物（394BP），根据制造商的草案反应物绑扎浸在PVP22/MYS-HIS-TOP 带菌者里。4带有镶嵌的质体DNA精制，核苷酸序列在ABI模型310DNA序列分解系统。大鼠通过腹膜内注射戊巴比妥纳麻醉，使用PH值7.4的含有4%多聚甲醛的标准冷盐水300ML完进行灌注。在温度4度条件下将内耳组织切开固定，在4%含量多聚甲醛里浸泡24小时，接下来用10%的乙二胺甲乙酸中进行脱钙处理。使用厚度在10um厚度的截面标本在冷的丙酮冷冻恒温箱中十分钟，使用浓度3%的双氧
7、水在甲醇里浸泡20分钟猝熄内源性过氧化物酶的活性处理（调质）。切面使用大块的免疫血清来导致突变，随后在4摄氏度的恒温下用一晚上事件来使用使用生物素酰化家兔抗大鼠和双剂量的抗生蛋白链霉素在单克隆技术下培育大鼠免疫多药抗药性蛋白。过氧物酶活性通过在包含0.02%的二氨基联苯胺、0.005%的双氧水和0.5%的镍硫酸氨三氯化铁的三胫甲基氨缓冲溶解液中培育形象直观的观察到。阳极控制安排使用大鼠脑部切片，阴极控制安排使用忽略最初的抗体或者使用形象匹配多发控制抗体大鼠免疫球蛋白来更换多药耐药性蛋白。大鼠内耳组织多药耐药性蛋白基因通过逆转录分析呈现结果。使用特定的大鼠多药耐药性蛋白基因标本在放大准备的394
8、对预期片段，取自脑部、耳蜗和耳蜗神经组织。通过按程序排列这些组织的聚合酶链式反应产物，可以确认的是这些聚合酶链式反应产物的核苷酸序列是和已经发行的大5鼠多药耐药性蛋白cDNA 完全相同的。大鼠脑部和耳蜗组织多药耐药性蛋白的分布和反应通过免疫组织化学方法染色在图片一中体现。在脑部，免疫组织化学的染色只能在脉络丛中体现二受限制于上皮细胞的使用。免疫反应性展示了一幅优先停留在基侧部位的。脉络丛中的免疫反应性确认在相同的位置对多药耐药性蛋白呈现阳性和其他地方检测的一样。在耳蜗中，多药耐药性蛋白免疫反应性被检测到在侧壁和耳蜗神经纤维里存在。在骨组织的染色检验被认定为非特异性的，因为在负面控制里同样可以得
9、到确认。皮层器官，毛细血管和其他的结构对多药耐药性蛋白不起免疫反应。在侧面的细胞壁里，阳极染色体被检测到在末端细胞的基部和血管纹的基部。微弱的免疫反应性在中间细胞中同样被检测到。螺旋韧带纤维细胞，螺旋凸上皮细胞表现出相对强烈的单克隆抗体性。内耳神经纤维在耳蜗轴和骨质螺旋薄片有免疫反应性，同时弱染色的免疫性在螺旋神经节神经元细胞中也被检测到。在最初的标本中使用形象匹配多发控制抗体的大鼠免疫球蛋白更换多药耐药性蛋白的，在上面的结构功能检测中没有阳极染色体血脑屏障和脑脊液屏障的功能为隔离中枢神经组织和循环药物以及其他项物质。血内耳屏障或血迷路屏障有和上6面相似的功能在中枢神经系统。从我们以前的报告来
10、看，抗药性限幅放大糖蛋白，在毛细血管内皮细胞表面活动的一种蛋白，在老鼠和几内亚猪的耳蜗被检测到，糖蛋白的外排性原理，让其像挤压泵一样排出耳毒性的基体药物，如阿霉素和长春花碱。基于以上结果，断定糖蛋白扮演了一个至上而下的流体屏障并且为血内耳屏障贡献了一个新原理功能。作为一个基体侧部的运输者，多药耐药性蛋白质，在大鼠和老鼠中被检测到。多药耐药性蛋白质，作为同源ATP依赖性有机阴离子转运蛋白-和癌症化学疗法障碍有牵连，同样广泛的活跃在不通过的标准组织里，包括上皮膜细胞。在脑部组织，多药耐药性蛋白不在毛细血管活动，而是在丙酸纤维素的上皮膜细胞。多药耐药性蛋白停留在基层部位，构筑一个从下而上的物质渗透屏
11、障。我们实验的结果，确定多药抗药性蛋白在血管纹、螺旋韧带、螺旋凸和耳蜗神经纤维。这项发现非常的有趣，因为这些部位都和生产和吸收内淋巴，外淋巴有关联。内淋巴和外淋巴以及脑脊髓液的离子组成是非常不同的，并在耳蜗产生有特征的电子流。内淋巴主要由血管纹组织产生和由螺旋凸组织、肠内沟和内淋巴囊再吸收。由于药物在人体系统管理下进入内淋巴的主要渠道是通过毛细血管，血管纹总体被认为是大分子在血液与内淋巴之间的选择性运输功能有联系的。从上述实验得知，血管纹和螺旋韧带可能在消除新陈代7谢所产生的废弃物、由内淋巴和外淋巴向血液渗透的的有害物质方面发挥了功能。在血管纹组织，多药耐药性蛋白的单克隆抗体标记技术被着重提及
12、在边缘细胞和基部细胞的基侧部位（fig 2E ）显示了 顶端到基底的药 物渗透途径。耳蜗神经纤维在试验中同样得到免疫化学染色。在外围神经，血液神经屏障在保护神经细胞和纤维化自身以免受毒害神经的物质侵害方面发挥重要作用。因此，多药耐药性蛋白活跃在耳蜗神经纤维组织可能对血液神经屏障的贡献大于血内耳屏障，产生维护耳蜗神经系统功能。这就是说血内耳屏障和血神经耳屏障是联合起来保护内耳的完整性。在血管纹、螺旋凸和耳蜗组织里，毛细血管的分配同样有影响力和糖蛋白丰富的存在毛细血管的上皮细胞里。同样，糖蛋白和多药耐药性蛋白运送有害性外源物质重叠却有结构排列和功能的不联系性，都自然产生药物、磷脂质和共轭化合物，假定这两种蛋白直接贡献于血内耳屏障。像图3中现实的，这两种蛋白可能会协调处理汇集进入内耳组织和排出有毒的物质。内淋巴里的有害物质，例如，会通过多药耐药性蛋白传输到上皮下的空间的边缘细胞沟，然后通过上皮毛细血管细胞内的抗药性糖蛋白渗透到血液系统。总的来说，糖蛋白和多药耐药性蛋白可能组成双机的构造来选择药物通过血内耳屏障，来保证耳蜗内较低浓度的有害物质和有益于健康的药物。无论如何，要澄清多药耐药性蛋白在内耳系8统所发挥的药理学作用还需要进一步的学习研究。9感谢：略参考文献：略
