1、概 述电泳是指带粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。例如蛋白质具有两性电离性质。当蛋白质溶液的 pH 在蛋白质等电点的碱侧时，该蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，相反则带正电荷，在电场中向负极移动。只有蛋白质溶液 pH 在蛋白质的等电点时静电荷是零，在电场中不向任何一极移动。电泳现象早在 1890 年就被发现，1907 年有人曾在琼脂中电泳，研究白喉毒素；1937 年由Tiselius 制成界面电泳仪，并开始用于蛋白质的研究。从此，人们才逐渐认 识到电泳技术对于生物科学研究是一种重要工具。然而，界面电泳结构复杂。价格昂贵难于普及。1940 年左右。以纸为支持物的电泳问世后，电泳技
2、术得到迅速发展。电泳技术以支持物分，可分为纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳，琼 脂（糖）凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。经凝胶形状分有水平平板电泳，园盘柱 状电泳及垂直平板电泳。各种类型的电泳技术概括如表。类 别 名 称用支持体的电泳技术 1.纸上电泳2.醋酸纤维薄膜电泳3.薄层电泳 4.非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)5.凝胶支持体区带电泳 淀粉液 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂（糖）凝胶不用支持体的电泳技术1.Tiselius 或微量电泳2.显微电泳 3.等电点聚焦电泳技术4.等速电泳技术5.密度梯度电泳 各类电泳技术已经广泛地用于基础理论研究，临床诊断及
3、工业制造等方面。例如用醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白；用琼脂对流免疫电泳分析病人血清，为早期诊断原发性肝癌提供资料；用高压电泳分离肽段，研究蛋白质一级结构；用高压电泳和层析结 合研究核酸的一级结构。凝胶电泳技术在分离分析酶。蛋白质，核酸等生物大分子方 面具有较高的分辩力，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。影响电泳的因素 不同的带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同。常用泳动度（或迁移率）来表 示。泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下泳的速度。影响泳动度的主要因素有： 1、首先决定于带颗粒的性质，即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状。一般说来，颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速
4、度快，反 之则慢。泳动度还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，泳动度与颗表面电 荷成正比，与介质粘度及颗粒半径反比。带电荷的高分子在电解质溶液中把一些带有 相反电荷的离子吸引在其周围，形成一离子扩散层。加以电场时，颗粒向符号相反的 电极移动即带阳电荷颗粒移向负极，带阴电荷颗粒移向正移；离子扩散层由于带有过 剩的与颗粒符号相反的电荷，可以向相反方向移动。结果颗粒与离子扩散之间的静电 引力使颗粒的泳动度减慢，另外，高分了颗粒表面有一层水，在电场影响下，它与颗 粒一起移动，可以认为是颗粒的一部分。2、电场强度电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对 泳动度起着十分
5、重要的作用。例如纸电泳。测量 25 厘米长纸条两端电压为 250 伏特， 则电场强度为250 伏特/25 厘米=10 伏特/厘米。一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度大小，可将电泳分 为常压电泳和高压电泳，前者的电压在 100-500 伏特，电场强度一般是 2-10 伏特/ 厘 米；后者电压可高达 500-1000 伏特，电场强度在 200-2000 伏特/厘米。常压电泳分离 时间需数小时至数天，高压电泳时间短，有时仅几分钟即可，高压电泳主要用于分离 氨基酸，肽，核苷酸，由于电压升高，电压也随之增大，故需冷却装置。 3、溶液的 pH 值溶液的 pH 值决定了带电颗粒解离的程度
6、，也决定了物质所带净电荷的多少，对于 蛋白质，氨基酸等两性电解质而言，溶液 pH 值离电点越远，颗粒所带净电荷越多；电 泳速度越快；反之则越慢。例如血清中几种主要蛋白质的等电点各不相同，白蛋白等 电点是 4.0。2 球蛋白等电点是 5.06， 球蛋白等电点是 5.1， 球蛋白等电点是 7.1。 当在 pH8.6 的电泳缓冲液中电泳时，这些蛋白质都带负电荷，它们的泳动速度是白蛋 白 球蛋白 球蛋白。因此，当要分离一种蛋白质混合物时，应选择 一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的 pH 值，以利于各种蛋白质分子的解离。同 时，为保持电泳过程中溶液 pH 恒定也须使用缓冲液。4、溶液的离子强度溶液的离
7、子强度是另一个重要选择的条件，在保持足够缓冲能力前提下，离子强 度要最小。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。通常缓冲液离 子强度选择在 0.05 - 0.1M 之间。浓度大的缓冲液在合适电压下，有较低的电阻和较大的电流，产热较高。如果这种额外的热可以驱散， 高浓度的缓冲液扩散常数较低，可以产生较窄细的电泳区带。离子强度很高时要用低 电压，避免过多产热，这样又导致长的电泳时间，以致增加变性和区带分离困难。5、电渗作用 在支持物的电泳中，影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。所谓电渗就是指在 电场中液体对固体支持物的相对移动，例如在 pH8.6 时，血清蛋白质进行纸电泳时， 球蛋白
8、与其他蛋白质一样带负电荷，应该向正极移动，然而它却向负极方向移动， 这就是电渗作用的结果。滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷，如一束毛细管，进行电泳时蛋白质通过这些孔隙向前移动。纸的孔隙带有负电荷，与带电颗粒一样可以 吸引正离子，因此介质沿管壁相对地带的较多的正电荷。在电场中，带负电荷的蛋白质向正极移动，而介质却向反向阴极移动，从而对蛋白质颗粒的泳动起阻碍作用。由 于 球蛋白分子颗粒大，净电荷较少，移动速度慢，电渗作用大于颗粒向前泳动的 力，结果 球蛋白向后退。而其他血清蛋白质，因分子较小，净电荷较多，电渗作用小于分子向前移动的力，因此分子向前移。所以，血清蛋白质电泳后球蛋白反而在点样位置之后
9、。琼脂糖凝胶电泳 在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，它具有下列优点：（1）琼脂含液体量 大，可达 98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附 极微。（2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。（3）电泳速度快。（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（5）区带易染色，样品易回收，有利于制止备。然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。而琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多 糖，含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。琼脂（糖）电泳常用缓冲液的 pH 在 6-9 之间，离子强度为 0.0
10、2-0.05。离子强度过高时，会有大量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水份量蒸发，析出盐的结晶，甚至可使凝胶断裂，电流中断。常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。 为了防止电泳时两极缓冲液槽内 pH 和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内的缓冲液，混匀后再用。琼脂糖电泳可用于分离、鉴定和提纯 DNA 片段。本法操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的 DNA 片段混合物，分开的 DNA 可用低浓度的萤光染料（0.5g/ml 溴化乙锭）染色，在紫外灯下直接观察检测少至 1ng 的 DNA。DNA 通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数：DNA 分子的大小：线奖双链 DNA 分子通过凝
11、胶的速率与其分子量的常用对数成反比。据此用已知分子量的标准物质和待测分子量的 DNA 片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分子大小。琼脂糖浓度：给定大小的 DNA 片段，以不同速度通过不同浓度的琼脂扩凝胶。因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的 DNA 片段。DNA 构型：相同分子量的闭环（型），开环（型）和线状（型）DNA，以不同速率通过凝胶，一般情况下，迁移率型型型。应用的电压：在低电压时，线状 DNA 片段的迁移率与所用电压成正比。但是压增高时，大分子量 DNA 片段迁移率的增大是不同的，因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。为了获得 DNA 片段的最大分
12、辨力，凝胶电泳时电压不应超过 5V/cm。不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围浓度 510520-30 15-20 10-15 5-10 2-5核酸 104 104-105 105-210610-20 5-10 2-3.6聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类，前者指整个电泳系统中所用缓冲 液，pH 值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓 冲液，pH 值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨 能力。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分
13、子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967 年，Shapiro 等发现阴离子去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量 SDS 和巯基乙 醇，SDS 可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白 质SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS 与蛋白质结合后，还可引起构象改 变，蛋白质SDS 复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物 的短轴长度都不一样，约为 18A，这样的蛋白质SDS 复合物，在凝胶中的迁移率，不 再受蛋白质
14、原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜是由醋酸纤维素加工制成的。醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体 有以下优点：电泳后区带界限清晰；通电时间较短（20 分钟至 1 小时）；它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸 水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。醋酸纤维素薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白，
15、血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。根据样品理化性质，从提高电泳速度和分辨力出 发选择缓冲液的种类，pH和离子强度。选择的缓冲液最好是挥发性强，对显色或紫外光等观察区带没有影响。若样品含盐量较高时，宜采用含盐缓冲液。例如血清蛋白 电泳可选用 pH8.6 的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液；氨基酸的分离则可选用 pH7.2 的磷酸盐缓冲液等。电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做 上记号，点上样品，在一定的电压，电流下电泳一定时间，取下滤膜，进行染色。不 同物质需采用不同的显色方法，如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位，但许多 物质必须经染色剂显色。醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下，溶于一定的溶剂中进行光密度测定。也可以浸于折射率为 1.474 的油中或其他透明液中使之透明，然后直接用光密度计测定。它的缺点是厚度小，样品用量很小，不适于制备。
