1、实验二 琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测一. 实验目的1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理;2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。二、实验原理溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB 可与 DNA 分子形成 EB-DNA 复合物，其发射的荧光强度较游离状态 EB 发射的荧光强度大 10 倍以上，且荧光强度与 DNA 的含量成正比。用肉眼观察，可检测到 5 ng 以上的DNA。1影响 DNA 在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： 1)DNA 分子大小 迁移速率 U 与 logN 成反比（N 为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA 结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（
2、超螺旋线性 DNA）2) 琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的 DNA Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb. 3)DNA 构象：一般迁移速率超螺旋环状线状 DNA单链开环4)所加电压：低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过 5V/cm 5)碱基组成与温度：一般影响不大 4 -30 6)嵌入染料的存在：降低线性 DNA 迁移率，(不提倡加在电泳液中) 7)电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳
3、动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致 DNA 变性，一般采用1TAE，1TBE，1TPE（均含 EDTA pH8.0）。 2溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。4、电泳缓冲液：TAE TBETAE 与 TBE 不同之处在于 TBE 用硼酸代替了 TAE 中的冰醋酸。三、仪器和试剂仪器微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉试剂琼脂糖：1.0%； 电泳缓冲液（50 TAE 电泳缓冲液取 Tris24.2g ，冰醋酸 5.7ml ， 0.25mo
4、l/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至 100ml ）EB：5 l / 100 ml TBE电泳材料：标准分子量核酸（DL2000）四、操作步骤（1）制胶（以 20 mL 为例）a. 称取 0.2 g 琼脂糖，加入 20 ml 的 TAE 缓冲液（pH 8.0），摇匀；b. 微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）； c. 将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约 50）加入 2ul EB 后，混均匀，倒入其中，直至厚度为 46 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约 30 45 min)；d. 将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子
5、，以保证点样孔完好。（2）点样用微量移液器将 5 l 含蓝色染液的 DL2000 加入点样孔下部。（3）电泳打开电源开关，调节电压至 35 V/cm(约 100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约 30-40 分钟后即可观察结果。（4）观察将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品 DNA 的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA 进行电泳，则可通过线性 DNA 条带的相对位置初步估计样品的分子量。五、实验结果与分析1、有条带跑完电泳后两边淡，中间较粗，很可能是由于点样时不均匀，两边点样较少；2、有条带跑完电泳后看不见，很可能是由于样品未加入点样孔，飘浮在电泳液里了六、思考题做琼脂糖凝胶电泳应注意哪些问题？1、加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则 DNA 的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。2、应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。3配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。4琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。5电泳时应注意电源线路，预防触电。6溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室内使用。7紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。
