1、精选文档实验五 核酸琼脂糖凝胶电泳一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。、实验原理琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同 DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率也不同。澳化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛
2、选重组子的目的。但是EBM有致癌性，所以我们选用无毒，高灵敏度是Ex Green染料，。此核酸染料在紫外透照仪及可见光透射仪上均可使用。ExGreen外观呈红色，与核酸结合后，可用 300 nm（紫外透射仪）激发。琼厢力跖疑胶浓度与线性DMA分离范围参数 凝胶浓度(%) 线性DZA长度(bp 0.5100030000 0.780012000 1.050010000 1.24007000 1 .52003000 2.050-2000三、材料、仪器和试剂1 、材料 大肠杆菌中提取的质粒 DNA2 、仪器电泳仪；台式离心机；恒温水浴锅；微波炉；紫外透射仪；照相机或者凝胶成像系统3、试剂(1) 50
3、X TAEfe泳缓冲液：称取Tris 242g , EDTA 37.2g ,加入约800ml的去离子水， 充分搅拌溶解，加入 57.1ml 的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容至1L ，室温保存。(2) 6 X电泳上样缓冲液：0.25%澳酚蓝、40% (W/V )蔗糖水溶液，贮存于 4 o(3)澳化乙锭(EB)溶液母液：将 EB配制成10mg/mL 。用铝箔或黑纸包裹容器， 贮存于室温即可。(4)分子量标准DNA ： DNA Marker四、操作步骤1 、制备 1% 琼脂糖凝胶(大胶用40ml ，小胶用 30ml) ：称取 0.7 g(0.5 g) 琼脂糖置于锥形瓶中，加入 70 ml(50ml)
4、 1 X TAE ,瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0% 琼脂糖凝胶液。注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的2、胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好， 形成模子。 将内槽置于水平位置， 并在固定位置放 好梳子。在冷却到 65 左右的琼脂糖凝胶液中加入 Ex Green 染料( 10ml:1ul ) ，混匀后小心地倒入内槽玻璃板上， 使胶液缓慢展开， 直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。 室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1X T
5、AE电泳缓冲液至没过胶板1-2 mm为止。注意： 必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则， 会造成电泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。倒胶时，不要产生气泡，溶液温度太高 （60 ），会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。3 、 加样： 在点样板或EP 管中混合 DNA 样品和上样缓冲液， 上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X 。 用 10 ul 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内， 每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染。加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。 （注意：加样前要先记下加样的顺序） 。注意： 加样时， 要把枪头插入到加样孔里
6、，但是不要插穿加样孔底部凝胶， 保证样品尽量在加样孔中而不外溢。4 、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V ，样品由负极（黑色 ）向正极（红色 ）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1cm 处时，停止电泳。5、电泳完毕后，取出凝胶6 、观察照相：在紫外灯下观察，DNA 存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。注意事项：1 、操作时带一次性手套，避免DNA 酶污染引起DNA 降解。2 、 及时更换电泳缓冲液， 电泳缓冲液在电泳槽中存放过， 多次使用后， 离子强度降低，PH 值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。3 、 一般情况， 电泳电压 20V/cm ， 温度 30 ； 大分子量 DNA 链电泳， 温度应 15 。4 、电泳前样品勿受热，以免引起DNA 变性。5 、凝胶中 DNA 的上量要合适，太多会引起DNA 条带模糊，太少又会引起条带信号弱或无 DNA 条带。思考题1、 琼脂糖凝胶电泳中 DNA 分子迁移率受哪些因素的影响？2、 如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？3、 4、可编辑
