1、DNA的琼脂糖凝胶电泳技术,引言：琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合线性分子，主要是由D半乳糖和3,6脱水L半乳糖连接而成的一种线性多糖，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂质。琼脂糖是一种聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。,一）琼脂糖凝胶电泳原理,琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0
2、-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。,在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。,二）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的范围,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,三）琼脂糖凝胶电泳技术
3、操作,仪器设备- 电泳仪 - 电泳槽 - 灌胶模具等,- 微波炉或电炉（溶化琼脂糖）,- 紫外透射仪或凝胶成像系统,2、试剂,1、 5TBE电泳缓冲液：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。2、 6电泳载样缓冲液：0.25 溴酚蓝，40(w/v) 蔗糖水溶液（或30 甘油），贮存于 4。 3、 溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。,常用电泳缓冲液,Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）,上样缓冲液,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰
4、色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： 增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 使样品呈色，使加样操作更方便。,核酸染色剂,溴化乙锭（EB） 一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。,注意事项： EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。,DNA分子量标准,1.凝胶制备 制备0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5TBE，加热至琼脂糖全
5、部熔化，冷却至50-60时，加入EB至终浓度0.5g/ml。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。 2.加样 取10l DNA样液与 2l上样buffeer混匀，用微量移液器小心加入样品槽。 3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为15V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。 4.观察拍照,四、操作步骤,凝胶制备,加样,电泳,观察拍照,四）影响核酸分子泳动率的因素,1、样品的物理性状即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。对线形分子来说，分子量的常用对
6、数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数-泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。,DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)，泳动率的大小顺序为：cccDNAIDNAocDNA，但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。,2、支持物介质 -琼脂糖一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择
7、取决于DNA分子的大小。,3、电场强度电场强度愈大，带电颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过4V/cm。而对于大片段电泳，甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。,4、缓冲液离子强度核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。,5、嵌入染料的存在荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15。,
