1、变性梯度凝胶电泳（DGGE）,hnxide,一、原理及定义,变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是 Lerman 等人于20 世纪 80 年代初期发明的，起初主要用来检测 DNA 片段中的点突变，DGGE 是最灵敏的突变检测方法，其效率可达99%（Grompe 1993）。Muyzer 等人在 1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究，现在该技术已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一,DGGE在微生物生态学中的应用,1）广泛应用于各微生物生态系统，包括土壤 ，活性污泥，人体和动物肠道，温泉，植物根系，
2、海洋，淡水湖，油藏等。绝大部分研究都是通过扩增细菌或古细菌的 16S rRNA 基因来研究各生态系统中的细菌或古细菌群落多样性。也有用真菌的通用引物扩增 18S rRNA 基因 ，从而研究真菌的群落多样性。,2）能快速同时对比分析大量的样品。因此它既可以对比分析不同的微生物群落之间的差异，也可以研究同一个微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程。 3）它可以跟踪监测细菌的富集和分离，从而评价不同培养基及培养条件对分离菌种的影响 4）检测单个纯菌 rRNA 基因的微异质性；比较不同的 DNA 提取方法；另外，它还可以辅佐筛选克隆文库以及检测 PCR 和克隆过程中的偏差,PCR反应 16SrDNA
3、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 解链温度,解链温度既使是很小的变化也会引起DNA片段Tm值的改变，如单碱基替代可引起1.5的差异,DGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的 DNA 片段区分开来,DGGE过程：1-2-3-4,思考：DGGE可以用来检测除最高温度解链区域以外的所有发生单个碱基变化的DNA片段，但是最后一个区域的解链，双链变单链，会出现什么结果？如何解决？,DGGE前PCR引物设计引物设计根据16S的一段保守序列设计，长度15-25bp,GC夹子:设计一段富含GC夹子的引物，使DNA 片段的一端加入一段富含 GC 的 DNA
4、 片段（GC 夹子，一般 30-50 个碱基对）可以解决双链DNA完全解链的问题,经验表明任何随机的GC序列都能达实验目的 含有GC 夹子的 DNA 片段最高的解链区域在 GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止 DNA 片段在DGGE胶中完全解链。当加了 GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。,凝胶变性剂浓度梯度的确定,在分析微生物群落的 PCR 扩增产物时，一般先要用垂直电泳来确定一个大概的变性剂范围,垂直电泳和水平电泳,A ：凝胶的变性梯度方向与电泳方向垂直。 B：左泳道，突变型等位基因；中，野生型等位基因；右，突变型与野生型等位基因,电泳时间的确
5、定,一般采用时间间歇（timetravel）的方法，即每隔一定时间加一次样品，从而使样品的电泳时间有一个梯度，根据这个结果，确定最佳的电泳时间 根据以往经验，参考文献,染色方法的选择：,溴化乙啶（ethidium bromide, EB），SYBR Green I, SYBR Gold和银染法。,染色法的优缺点,EB 法染色的灵敏度最低，且致癌，但价廉。 SYBR Green I 和 SYBR Gold 相比 EB，能更好地消除染色背景，因此它们的检测灵敏度比 EB 法高很多。 EB 和 SYBR 染色时，双链 DNA 能很好地显色，单链 DNA 基本上不能显色。 银染法的灵敏度最高，它不但能
6、染双链 DNA，也能染单链 DNA，但它的缺点是不能用于随后的杂交分析,三、DGGE 法的优缺点,突变体检测 优点 1、几乎可以检出所有突变 2、可将突变分子完好无损地同野生型分子分开用于进一步的分析 3、无须标记 4、电泳前只需一步操作 5、可用于未经扩增的基因组 DNA 6、可检测出象甲基化这样的 DNA 修饰,缺点 1、需要专门设备需要用计算机对序列进行分析 2、需要进行预实验需要昂贵的“ GC 夹板” 3、无法确定突变在 DNA 片段中位置 4、需要用含有毒性物质甲酰胺的梯度凝胶 5、DNA 片段大小限制在 100-500bp,微生物生态学中应用的缺点,除了前面提到过的一些优缺点，分析
7、微生物群落结构组成是还存在以下缺点： 1、分析微生物群落结构组成时，有很多偏差。不同细菌的基因组大小和核糖体 RNA 拷贝数不同；提取基因组总 DNA 时细胞的裂解效率不同；DNA提取和纯化时有偏差；PCR 扩增过程中有偏差。 2、DGGE一般只能分析 500 个碱基对以下的 DNA 片段，因此得到的系统进化相关的信息就很少,做DGGE注意事项,1、配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。 2、制胶是实验的关键，用连有聚乙烯管标有高浓度的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上，在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。 3、分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确! 再将注射器的聚丙烯管同 Y 形管相连。,4、灌完胶后，立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。 5、DGGE 的电泳缓冲液要超过“RUN”刻度线，不要超过“Maximam”刻度线。 6、点样时，要用小型注射器，伸入点样孔底部点样。 7、剥胶和照相要格外小心，凝胶很薄，容易破裂。 8、每次用完仪器后要及时清理，清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。,
