1、青岛农业大学毕业论文（设计）题 目： 马铃薯 M 病毒重组 CP 抗血清的制备 姓 名： 学 院： 生 命 科 学 学 院 专 业： 生 物 技 术 班 级： 2010 级 3 班 学 号： 20103581 指导教师： 郭 宝 太（教授） 完成时间： 2014.6.15 2014 年 6 月 15 日目录摘要 .1Abstract. .2引言 .31 材料与方法 .51.1 实验材料 .51.1.1 实验菌株 .51.1.2 主要试剂与仪器 .51.1.3 培养基 .51.1.4 主要试剂配方 .51.2 方法 .81.2.1 PVM-CP 基因原核表达的诱导与鉴定 .81.2.2 菌体总蛋
2、白的提取和包涵体的溶解 .81.2.3 PVM 重组 CP 的纯化 .91.2.4 纯化蛋白的 SDS-PAGE 检测 .91.2.5 蛋白的透析、浓缩与定量 .91.2.6 PVM 重组 CP 抗血清的制备 .91.2.7 PVM 的 ELISA 测定 .102 结果与分析 .102.1 目的蛋白的诱导表达与纯化 .102.2 蛋白的透析、浓缩与定量 .112.3 抗血清效价的测定 .122.4 PVM 的 ELISA 测定 .133 讨论 .133.1 马铃薯病毒的检测方法 .133.2 目的蛋白的纯化与定量 .143.3 重组 CP 途径与本研究的创新点 .143.4 马铃薯病毒抗血清的
3、生产与应用致谢 .15参考文献 .151马铃薯 M 病毒重组 CP 抗血清的制备生物技术专业 刘 扬指导教师 郭宝太摘要：用 IPTG 诱导重组菌 BL21(pET22b-PVM)中马铃薯 M 病毒 CP 基因的原核表达，在总蛋白 SDS-PAGE 图谱上有一条分子量 36kDa 的特异蛋白带，符合预期大小，结果表明PVM-CP 基因的原核表达非常成功。用溶菌酶方法首先提取细菌总蛋白，然后利用镍离子亲和层析纯化重组蛋白，获得了高纯度的 PVM 重组 CP。利用高纯度重组 CP 免疫家兔制备出了抗血清，间接 ELISA 法测定显示抗血清的效价为 1：64K 。制备的抗血清与 PVM 阳性物呈阳性
4、反应，也就是说本研究制备的抗血清具有检测 PVM 的能力。本研究利用重组CP 制备出了 PVM 高滴度的抗血清，为进行 PVM 的 ELISA 检测奠定了基础，同时也为PVM 的 ELISA 试剂盒的组装与应用奠定了基础。关键词：马铃薯 M 病毒； CP 基因；原核表达； 重组 CP；抗血清制备2Preparation of antiserum against recombinant coat protein of potato virus MStudent majoring in biotechnology Liu YangTutor Guo BaotaiAbstract: The reco
5、mbinant bacterium strain BL21(pET22b-PVM) was induced by IPTG, a 36KD specific protein band was found in the SDS-PAGE pattern of total protein, its size was the same as expected, the result showed that the prokaryotic expression of CP gene of potato virus M (PVM) was successful. Total cellular prote
6、in of the recombinant bacterium was extracted by lysozyme method and then the PVM recombinant CP was purified with nickel iron affinity chromatography column. Antiserum was prepared by injection of rabbits with the high-purity recombinant CP. Indirect ELISA detection indicated that the titer of the
7、antiserum was 1:64K. Positive reaction was observed between the prepared antiserum and PVM positive sample in ID-ELISA. The antiserum prepared in this research has the ability to detect the PVM. In this research, high titer antiserum of PVM was prepared by the use of recombinant CP, it has laid the
8、foundation for the ELISA detection of PVM, and also laid the foundation for the assembly and application of ELISA detection kit for PVM. Key words: potato virus M; coat protein (CP) gene; prokaryotic expression; recombinant CP; preparation of antiserum3引言马铃薯(Solanum tuberosum L.)是茄科茄属的一年生草本植物，食用部分为块
9、茎。马铃薯是非常重要的粮、菜兼用作物。马铃薯在我国的种植范围较广，但对于单位面积的产量而言，却与马铃薯生产发达的国家有一定的差距。导致这种局面的重要原因之一就是病毒积累引起的种薯退化，这在很大程度上限制了马铃薯产业的发展 1。马铃薯满足人们对经济作物的各种要求，同时它可以加工成各种工业产品，使用及其广泛。遗传上马铃薯是同源四倍体的作物，虽然可以有性繁殖，但一般利用块茎进行无性繁殖。常规育种技术用于马铃薯会遇到诸多问题与困难。另外，采用常规的杂交育种方法改良马铃薯品种效率低，过程复杂而且所花费的时间很长。马铃薯病毒能够导致马铃薯品种退化，具体表现是既影响马铃薯的产量，也会造成质量的严重下降 2。
10、马铃薯病毒严重制约了马铃薯的产业化，当发生复合侵染时，产量损失更高。马铃薯病毒病的种类繁多，在我国已发现 10 种以上的病毒，其中常见的马铃薯病毒主要就有六种 3。马铃薯M病毒( Potato virus M, PVM )是香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）成员，它的基因组为正单链RNA病毒 4。基因组序列中有 6个ORFs ，另外5端有长度为75个核苷酸非编码区，3端有70个核苷酸的poly(A) 5。其中外壳蛋白（CP ）是由第三个编码序列中的一个ORF 编码的，其大小约为34kDa 5。PVM通过接触传病，分布范围广，可造成大面积减产。目前为止，防治马铃薯病毒，减少其危害的最有效途
11、径是使用无毒种薯。通过茎尖剥离与培养扩繁，可以获得大量无毒（脱毒）试管苗，并可进一步获得脱毒微型薯与种子。病毒脱除难度与效果，因病毒种类不同而异，PVM的脱除就比较困难。对脱毒材料进行严格地检测与筛选，才能获得真正的脱毒材料，进一步保障生产上脱毒种薯的增产效果。植物病毒检测方法可以归纳为三大类：生物实验法，基于核酸的分子检测方法及免疫学（血清学）方法 6。马铃薯病毒检测的方法很多，但用于马铃薯种苗病毒检测的方法要求迅速、廉价、无误。基于核酸的分子检测方法是在PCR反应基础上建立起来的检测技术， PCR方法特异性好，灵敏度高。但是该4法对仪器和操作人员要求较高，不太合适于现场诊断。生产上适合于对
12、大量样品进行的检测的主要方法是酶联免疫吸附（ELISA）法。 ELISA检测法仍然是国际马铃薯中心认可的马铃薯病毒检测的最基本方法。获得纯化的特异性抗体及酶标记抗体是有效开展ELISA检测的关键。检测中可用肉眼或比色法判断测定结果。ELISA 用于检测马铃薯病毒始于Caspe对马铃薯卷叶病毒 (PLRV)的检测，认为用ELISA 技术进行PLRV 的常规鉴定是可行的 7。免疫学方法的灵敏度高、特异性强、技术步骤比较简单、能够对大量田间样品进行检测。ELISA仍然是当前生产应用最方便、最广泛的检测技术。大量产出高效价的抗血清是免疫学方法应用的关键。在经典的方法中，马铃薯病毒抗血清制备的抗原是提纯
13、病毒粒子。但是用这种方法制备抗血清存在很多弊端。有些病毒在宿主的含量少，难以获得足够的纯化后的抗原。还有一些病毒纯化困难，不易得到纯化的病毒粒子。由于病毒粒子制备的困难，导致国产马铃薯病毒抗血清非常缺乏，明显影响了其应用。利用分子生物学技术可以解决经典方法中遇到的抗原（马铃薯病毒粒子）制备困难问题。具体方法就是利用原核表达的重组CP 作抗原制备出马铃薯病毒抗血清。研究表明可以利用重组CP途径（基因工程途径）来制备检测马铃薯病毒抗血清。但目前未见马铃薯重组CP抗血清（抗体）用于大量样品 ELISA检测的报道，也未见重组CP多克隆抗体用于组装 ELISA检测试剂盒的报道，相关的研究有待深入。Cer
14、ovska8等克隆了PVM的CP基因并制备了重组CP的抗血清，且成功用于Wsetern分析。国内未见 PVM-CP基因原核表达的研究。本研究目的是利用重组 CP 制备出 PVM 高效价的抗血清，为实现基于重组CP 多克隆抗体的 DAS-ELISA 检测技术的建立奠定基础，同时也为 PVM 抗血清及 ELISA 检测试剂盒的国产化与大量生产提供技术保障。本研究的具体的研究内容是：1）诱导重组菌 BL21(pET22b-MCP)中 PVM-CP 基因的表达。 2）提取并溶解包涵体、利用镍离子亲和层析法纯化出重组CP，并进行透析、浓缩与定量。3）利用高纯度重组 CP 免疫家兔制备出高效价抗血清。 4
15、）抗血清效价测定及 PVM 的 ELISA 测定。 51 材料与方法 1.1 实验材料1.1.1 实验菌株重组菌BL21(pET22b-PVM)由本实验室构建并保存。1.1.2 主要试剂与仪器三氯乙酸、SDS、Glycine、Urea、Acrylamide、Bis-arcylamide、二抗（上海生工）；咪唑（北京鼎国）；去氧胆酸钠（上海伯奥）；蛋白酶抑制剂(PMSF)(Sigma)；蛋白质 Marker；溶菌酶（北京索莱宝） ；蛋白纯化柱(HiTrap Chelating HP)(HE Heacthcare)。其它试剂均为分析纯试剂。超净工作台（安泰公司）振荡培养箱（上海博迅）电子天平（Sa
16、torius）pH 仪（DENVER）观片灯（山东兖州通用医疗器械有限公司）恒温循环仪（北京六一）聚丙烯酰胺凝胶制备系统（Bio-Rad）微型垂直板电泳装置（Miniprotean,Bio-Rad ）水平脱色摇床（北京六一）1.1.3 培养基LB 固体和液体培养基，调 pH 至 7.4,高压蒸汽灭菌 121下 15min。氨苄抗性的筛选平板1.1.4 主要试剂配方12%分离胶：蒸馏水 5.9mL30% arc-Bis 7.2 mL1.5M Tris(pH 8.8) 4.3 mL10%SDS 180L10% Aps 180L6TEMED 7L5%浓缩胶：蒸馏水 2.75mL30% arc-Bis
17、 650L1.5M Tris(pH 8.8) 500L10%SDS 40L10% Aps 40LTEMED 4L脱色液配制：蒸馏水 500ml95%乙醇 400mL冰醋酸 100mlPBS 配制：KH2PO4 0.27gNa2HPO4 1.42gNaCl 8gKCl 0.2g加去离子水 800mL，搅拌溶解，加入浓盐酸调 pH 至 9.6，最后定容到1L。高温高压灭菌后室温保存。考马斯亮蓝 G250（5）染液配制：考马斯亮蓝 G250 20mg95%乙醇 10mL浓磷酸 20mL 定容至 40mL，4保存。使用时，用 PBS 稀释为 1考马斯亮蓝 G250。7结合缓冲液：NaH2PO4 0.0
18、2MNaCl 0.5MUrea 8M咪唑 20mM洗脱缓冲液：NaH2PO4 0.02MNaCl 0.5MUrea 8M咪唑 0.5M碳酸盐缓冲液（pH 9.6）：Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g加去离子水 800mL，搅拌溶解，加入浓盐酸调 pH 至 9.6，最后定容到1L。PBST 洗涤缓冲液：PBS 缓冲液 100mLTween20 50L封闭液：0.25g BSA 加 PBST 缓冲液至 5mL。底物缓冲液（pH 5.0）：柠檬酸 1.02gNa2HPO4 3.68g溶于去离子水中，调 pH 5.0，定容至 100mL。TMB 使用液：TMB（ 1mg/mL 溶于 DM
19、SO） 1mL8底物缓冲液 9mL30%H2O2 1L1.2 方法1.2.1 PVM-CP 基因原核表达的诱导与鉴定1）用接种环以无菌操作挑取重组菌 BL21(pET22b-PVM)菌液一环，划线接种于含有 100g/mL Amp 的 LB 固体培养液，37培养 24h。2）挑取重组菌 BL21(pET22b-PVM)的单菌落接种在 10ml 含有 100g/mL Amp的 LB 液体培养液，37震荡培养过夜。3）菌种按 1%的接种量接种于 200ml 含相同浓度 Amp 的 LB 液体培养基中，37震荡培养 2.5-3 小时左右，测 OD600 达到 0.6-0.9 可开始诱导。4）诱导前，
20、接出 1ml 未诱导的菌液作为对照。5）向剩余培养液中加入 1%培养液体积的 100mM IPTG(终浓度 1mM)诱导表达，37震荡培养 4h 左右。6）接出 2mL 诱导的菌液分别装入 2 个 1.5ml 离心管中作为诱导样。7）SDS-PAGE 检测诱导效果。1.2.2 菌体总蛋白的提取和包涵体的溶解1）将上述步骤中剩余的 197ml 在 4下、4000rpm 离心 15min。2）弃去离心上清液，对沉淀进行称重，加入裂解缓冲液（每克大肠杆菌加入 3ml） ，将菌体重悬。3)每克大肠杆菌中加入 8LPMSF（50mM）和 80L 溶菌酶（10mg/mL） 。4)边搅拌边加入少量去氧胆酸钠。5)等待裂解液变稠，每克大肠杆菌中加入 20LDNase(1mg/mL)。6)室温下放置 30min 左右，至裂解液不再粘稠。7)将裂解液分装在 1.5ml 离心管中，用微量离心机于 4、12000rpm 离心2min。8) 沉淀进行包涵体溶解：弃掉上清液，每管沉淀中加入 750L 结合缓冲液，吹打重悬沉淀，再加入 750L 结合缓冲液，震荡均匀，约 1min 后 4，12000rpm，离心 10min；收集上清液，重复上述步骤，加入 750L 结合缓冲液吹打重悬，12000rpm，4离心 15min，收集上清液。
