1、1实验三 酶联免疫吸附试验（ELISA）一 、 实 验 目 的了 解 ELISA 的 基 本 原 理 ， 掌 握 间 接 ELISA 方 法 的 原 理 与 操 作 步 骤 。二 、 实 验 原 理将 抗 原 或 抗 体 固 化 于 某 种 载 体 的 表 面 ， 并 保 持 其 免 疫 活 性 ， 加 入 待 检 血 清 （ 抗 体 ）， 然 后 加 入 与 其 相 对 应 的 既 有 酶 活 性 又 有 免 疫 活 性 的 酶 标 抗 体 或 抗 原 ， 它 们 之 间 反 应 后 ，通 过 洗 涤 去 掉 未 结 合 的 标 记 物 。 加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的
2、 降 解 底 物 和 呈 现 的 色 泽 在 一 定 条 件 下 是 呈 正 比 的 ，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因 此 可 用 分 光 光 度 计 进 行 测 定 ， 计 算 出 参 加 反 应 的 抗 原 或 抗 体 的 含 量 ， 从而 达 到 测 定 抗 原 或 抗 体 的 目 的 。常用酶及底物常用酶 底物 加终止液前颜色 加终止液后颜色辣根过氧化物酶（HRP）RZ3.1碱性磷酸酶（AP）邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黄色蓝色黄色棕黄色黄色黄色根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用的三
3、种类型： 1、间接法测抗体（间接 ELISA）2间接法用于测定抗体。它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。2、双抗体夹心法（双抗夹心 ELISA）双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇 A 和 B 分别与固相载体上的抗体 A 和酶标记抗体 B 结合，形成抗体 A-待测抗原 -酶标抗体 B 复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。底物的降解量抗原
4、量。 3、竞争 ELISA竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。三 、 主 要 仪 器 及 试 材以 伪 狂 犬 全 病 毒 （ PRV） 间 接 酶联免疫吸附试验（PRV ELISA） 为 例 。使 用 猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含:1、包被抗原的微孔板 ；2、阴、阳性对照血清； 3、抗猪 IgG-HRP 结合物； 4、洗涤液；5、底物 A 液、B 液；6、终止液 ；7、样
5、品稀释液 本 实 验 所 需 仪 器 和 试 剂 ：1、 酶 联 免 疫 测 定 仪2、 已 包 被 抗 原 （ Ag） 的 酶 标 板 （ PRV 蛋 白 ）3、 血 清 ： PRV 阳 性 血 清 、 PRV 阴 性 血 清 、 待 检 样 品 血 清4、 酶 标 抗 体 （ E-Ab） ： 兔 抗 猪 IgG-HRP5、 包 被 液 （0 .025mol/L pH9.6 碳 酸 盐 缓 冲 液 ） ： 1.59g NaCO3，2.93g NaHCO 3，加ddH2O 至 1000mL6、 洗 涤 液 （ 0.05% Tween-20 的 PBS（ pH7.4） ） ： 8.0g NaCl
6、，0.2g KCl，2.9g Na2HPO412H2O，0.2g KH2PO4， 0.5mL 吐温-20（Tween-20） ，加 ddH2O 至1000mL。37、 保 温 液 （ 含 0.1% BSA 的 洗 涤 液 ） ： 0.1g 牛血清白蛋白（BSA） ，洗涤液 100mL8、底 物 液 （ TMB-H2O2） ：磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）：25.7mL 0.2mol/L Na 2HPO4，24.3mL 0.1mol/L 柠檬酸液，加 50mL ddH2O。TMB 母液：0.2g TMB 干粉溶于 100mL 无水乙醇中配制而成。底物液（TMB）：新鲜配制。TMB 母液用底
7、物缓冲液按 120 的比例稀释，每毫升底物液加入 0.2L 30% H 2O2。9、终 止 液 ： 0.25% 氢 氟 酸四 、 实 验 方 法 与 步 骤（一）试剂配制1、 包 被 液 （0 .025mol/L pH9.6 碳 酸 盐 缓 冲 液 ） ： 1.59g NaCO3，2.93g NaHCO 3，加ddH2O 至 1000mL2、 洗 涤 液 （ 0.05% Tween-20 的 PBS（ pH7.4） ： 8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na2HPO412H2O，0.2g KH 2PO4，0.5mL 吐温-20（Tween-20） ，加 ddH2O 至 1000m
8、L。3、 保 温 液 （ 含 0.1% BSA 的 洗 涤 液 ） ： 0.1g 牛血清白蛋白（BSA） ，洗涤液 100mL。4、 底 物 液 （ TMB-H2O2） ：磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）：25.7mL 0.2mol/L Na 2HPO4，24.3mL 0.1mol/L 柠檬酸液，加 50mL ddH2O。TMB 母液：0.2g TMB 干粉溶于 100mL 无水乙醇中配制而成。底物液（TMB）：新鲜配制。TMB 母液用底物缓冲液按 120 的比例稀释，每毫升底物液加入 0.2L 30% H 2O2。5、 终 止 液 ： 0.25% 氢 氟 酸（二）实验步骤1、取已包被伪狂
9、犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用） ，用样品稀释液（PBS）将待检样品 140 稀释后加入板孔中，每孔加 100l。同样 140 稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设 2 孔，每孔 100l。另设一空白对照孔，空白对照孔加100l 稀释液（PBS） 。轻轻振匀孔中样品（勿溢出） ，置 37温育 2030 分钟。2、洗板：甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板 3 次，每次 23 分钟，200l/孔，每次在干净吸水纸上拍干。3、每孔加酶标二抗（抗猪 IgG-HRP 结合物）100l，置 37温育 2030 分钟。4、洗板：洗涤 3 次（方法同步骤 2） 。45、显色与终止：每孔加底物
10、A 液、B 液各 1 滴(50l)，混匀。室温避光显色，10 分钟后，每孔加终止液（0 .25% 氢 氟 酸 ） 1 滴(50l)，终止反应。6、15 分钟内测定结果。采用波长 630nm 的酶标仪测定 OD 值。检测样本的 OD 值0.4为阳性。五 、 实 验 注 意 事 项1、实验前血清样品必须置 37灭活 30 分钟。2、 在 ELISA 的 整 个 操 作 过 程 中 ， 洗 涤 是 不 可 缺 少 的 重 要 步 骤 ， 每 加 一 层 反 应 结 束后 均 要 洗 涤 固 相 载 体 反 应 板 ， 目 的 在 于 防 止 重 叠 引 起 非 特 异 性 吸 附 。 洗 涤 过 程
11、 中 的 助溶 剂 吐 温 20 具 有 降 低 非 特 异 吸 附 的 作 用 。 洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。3、加入底物液后应该室温避光，结果判断须在 10 分钟内完成。六 、 实 验 结 果 处 理以空白孔调零，在酶标仪上测各孔 OD630值。试验成立的条件是阳性对照孔平均 OD630值大于或等于 1.0，阴性对照孔平均 OD630 值必须小于 0.2。 样品 OD630值大于 0.4，判为阳性；样品 OD630 值在 0.38 到 0.40 之间，判为可疑；样品 OD630值小于 0.38，判为阴性。七 、 思 考 题1、间接酶联免疫吸附试验的原理。2、鉴别诊断基本原理及其意义。3、间接酶联免疫吸附试验检测的临床意义。
