1、肉制品中亚硝酸盐的检测 盐酸萘乙二胺法,亚硝酸盐的性质,亚硝酸和硝酸钠盐和钾盐：食品添加剂，发色剂 亚硝酸盐（150-200mg/kg）可抑制腌肉中的梭状芽孢杆菌 亚硝酸盐中毒剂量是200毫克以上，控制含量在安全范围内使用不会对人体造成危害,实验要求,掌握肉制品的前处理方法 分光光度法的使用 标准曲线测定及绘制,原 理,样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N-1-萘基乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准比较定量。,实验操作,样品处理 称取约10.00 g经绞碎混匀样品，加70 mL 水和12 mL氢氧化钠溶液（20 g/L），混匀，用氢氧化钠溶液（20 g
2、/L）调样品pH=8，定量转移至200 mL容量瓶中加10 mL硫酸锌溶液，混匀。 置60水浴中加热10 min，取出后冷至室温，加水至刻度，混匀。放置0.5 h，用滤纸过滤，弃去初滤液20 mL，收集滤液备用。,亚硝酸钠标准曲线的绘制,用移液管精确吸取亚硝酸钠标准液(5g/mL) 于一组 25 mL 比色管中 分别加 4.5 mL氯化铵缓冲液，加2.5 mL 60%乙酸后立即加入5.0 mL显色剂，加水至 25mL，混匀，在暗处静置 25 min 用1 cm比色杯，以零管调节零点，于波长550 nm处测吸光度，绘制标准曲线。,取7支25mL比色管，按下表配制标准色列：,样品测定： 吸取10.
3、0 mL样品滤液于25 mL带塞比色管中，分别加入4.5 mL氯化铵缓冲液，加2.5 mL60%乙酸后立即加入5.0 mL显色剂，加水至刻度，混匀，在暗处静置25 min用1 cm比色杯（灵敏度低时可换2 cm比色杯），以零管调节零点，于波长550 nm处测吸光度。,结果计算,式中：X1样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg； m1样品质量，g； m2测定用样液中亚硝酸盐的质量，g； V1样品处理液总体积，mL； V2测定用样液体积，mL。,思考题,样品前处理过程中使用氢氧化钠和硫酸的目的是什么？ 我国食品添加剂使用卫生标准中对亚硝酸盐有什么要求？,蔬菜中有机磷农药残留的测定 气相色谱法,有机磷农药
4、的种类 高毒品种：对硫磷、内吸磷、甲胺磷、毒死蜱、甲拌磷等；低毒品种：乐果、敌百虫、马拉硫磷、二嗪磷、杀螟松等。,图 有机磷杀虫剂的结构,有机磷农药残留的特点,化学性质不稳定，分解快，在作物中残留时间短，室温条件下，果蔬中有机磷农药的生物半衰期为717d。主要污染植物性食品，粮食、水果、蔬菜，特别是蔬菜容易吸收有机磷农药。,实验要求,掌握农药的固相萃取柱的制作及其使用 旋转蒸发技术 气相色谱仪的操作、外标定量法。,实验原理,样品中有机磷农药经有机溶剂提取和固相萃取净化，用配有氮磷检测器（FTD）的气相色谱仪检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。,农药残留检测的过程 提取 有机溶剂 净化
5、液液萃取、固相萃取 检测 酶抑制、免疫法、仪器法,利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和富集目标化合物的目的。 佛罗里土、氧化铝、硅胶,固相萃取 SPE （Solid Phase Extraction）,固相萃取,实验操作,层析柱的制备取层析柱，在底部装填无水硫酸钠约1cm厚，再填充活性碳及中性氧化铝的混合物（各0.5g，混匀），上部再填充无水硫酸钠约1cm厚，使用之前用10mL 二氯甲烷/丙酮（97/3, v/v）预先淋洗,实验操作,取切碎的菠菜5g于50mL离心管中，加入10g无水硫酸钠，20mL二氯甲烷/丙酮（97/3,
6、v/v），混匀，超声提取10min，4000r/min 离心 10min。 取10 mL上清液过层析柱，柱中残留用10mL二氯甲烷/丙酮淋洗，收集于50mL鸡心瓶中减压旋转蒸发至约为1mL， 用丙酮转移至5mL容量瓶，定容，0.45m滤膜过滤，2L进样。记录峰面积。,减压旋转 蒸发仪,气相色谱参考条件,色谱柱：BP5 25m0.32mm(内径)石英毛细管柱。 气体流速： 氮气： 50mL/min 尾吹气(氮气)： 30mL/min 氢气： 0.5kg/cm2 空气： 0.3kg/cm2 温度： 柱温采用程序升温方式 140 50/min 185 恒温2min 2/min 195 10/min
7、235 进样口温度240 检测器：氮磷检测器(FTD)。,计算 hiEsiV1 Xi = hsiV2m 式中: Xi样品中i组分有机磷含量,mg/kg; Esi注入标样中i组分有机磷的含量,ng； hi样品的峰面积,mm； hsi标样中i组分的峰面积,mm, V1浓缩定容体积,mL； V2注入色谱样品的体积,L； m样品的质量,g。,仪器分析,毛细管气相色谱法（GC）电子捕获检测器（ECD）火焰光度检测器（FPD）氮磷检测器（NPD） 质谱检测器（MSD）：GC-MS、HPLC-MS,ALS参数,阀参数,进样口,色谱柱,柱 箱,检测器,信号通道,辅助加热区,时间表,其它选项,化学工作站气相色谱
8、参数,思考题,固相萃取填料活性碳、氧化铝和无水硫 酸钠在样品净化过程中分别起到什么样的作用？使用减压旋转蒸发仪应注意哪些事项？微孔滤膜的作用是什么？有哪几种常用 类型？,水产品中土霉素残留的测定 液相色谱法,实验要求,掌握固相萃取柱的使用 掌握固相萃取仪的使用 掌握微孔滤器的使用 学习高效液相色谱仪的操作 掌握外标定量法,实验原理,样品中土霉素残留经5高氯酸提取及C18固相萃取净化，用配有紫外检测器的液相色谱仪测定，外标法定量。,固相萃取操作程序,（1）活化吸附剂萃取之前要用适当的溶剂淋洗小柱，以使吸附剂保持湿润，可以吸附目标化合物或干扰化合物。,操作程序,（2）上样（吸附） 样品倒入活化后的
9、固相萃取小柱，然后利用抽真空，加压或离心的方法使样品进入吸附剂。,操作程序,(3)洗涤（去除杂质） 在样品进入吸附剂，目标化合物被吸附后，可先用较弱的溶剂将弱保留干扰化合物洗掉。,操作程序,(4) 洗脱和收集再用较强的溶剂将目标化合物洗脱下来，加以收集。,固相萃取仪,固相萃取柱： SepPak柱 含碳十八硅胶，5ml，LC-18， Supelco Park，Bellefonte，USA,实验操作,取5 g肉于50 mL离心管中，用10 ml 5高氯酸匀浆，涡旋振荡 1min，4000r/min离心 10min。 萃取柱先用 10mL甲醇、10mL 5 EDTA-Na2和10mL 超纯水平衡。弃
10、去洗脱液，样品上清液以约 2mL/min 过柱，用10mL 超纯水洗去柱中杂质，土霉素以10mL 甲醇洗脱， 洗脱液在40水浴中以氮气吹干，残余物用 1mL流动相溶解，0.45m滤膜过滤，20L进样。记录峰面积。,色谱条件 检测波长：260nm 流动相：CH3CNNaH2PO4（ 0.01mol/ L ，pH 2.5）v/v22/78 流动相流速：1.0 mL/min 柱温：37 进样量： 20 L,化学工作站液相色谱参数,图3.5 OTC标准HPLC色谱图,计算 hiEsiV1 Xi = hsiV2m 式中: Xi样品中i组分土霉素含量，mg/kg; Esi注入标样中i组分土霉素的含量，ng
11、； hi样品的峰面积，mm； hsi标样中i组分的峰面积，mm, V1样品定容体积，mL； V2注入色谱样品的体积，L； m样品的质量，g。,思考题,影响固相萃取效率的主要因素有哪些？ 常用的固相萃取柱有哪几种？我国食品卫生标准中的土霉素最大残留限量是多少？,食品中无机砷的测定 银盐法,实验要求,掌握海藻干制品无机砷测定的前处理方法 掌握砷测定仪的使用,海藻中的砷化合物,海藻是目前含砷最高的食物之一，海藻干重的总砷含量在20-60mg/kg。 海藻砷化合物包括无机砷化合物亚砷酸盐、砷酸盐，和有机砷单甲基砷酸、二甲基砷酸、砷糖等。 海藻中的砷主要为有机砷，无机砷所占比例很小，而有机砷则主要为砷糖
12、。,食品中砷的允许量无机砷：大米 0.15 mg/kg；豆类 0.1 mg/kg；果蔬/肉类/蛋/贝虾蟹类/鲜乳 0.5mg/kg藻类 1. 5 mg/kg总砷：食用油脂 0.1 mg/kg果汁 0.2 mg/kg食糖 0.5 mg/kg,实验原理,样品在6mol/L盐酸溶液中，经70水浴加热后，无机砷以氯化物的形式被提取， 然后用碘化钾和氯化亚锡将砷酸还原为亚砷酸(H3AsO3)，亚砷酸再由锌和盐酸作用所产生的氢还原为气态砷化氢。 砷化氢被导入吸收液与银(DDC)作用，游离出的胶状银，呈红色，其色泽深浅与砷含量的关系符合比耳定律，可在510nm波长下比色测定其吸光值，与标准系列比较定量。,测
13、砷仪,实验操作,样品处理：称取5 g 粉碎海藻样品，至于100mL 具塞锥形瓶中，加入30mL HCl，摇匀，至于70水浴30min，取出冷却，用纱布过滤，用20mL 水洗锥形瓶及滤渣，合并滤液于测砷仪锥形瓶中，使体积约为50mL左右。 标准准备：吸取7.5ml 砷标准使用液至于测砷仪锥形瓶中，加水至50mL，加入8mL 盐酸（1：1）,实验操作,将乙酸铅棉花塞入导气管中。取4 mL二乙基二硫代氨基甲酸银溶液倒入吸收管。称取3g 锌粒。将锥形瓶、弯管、吸收管连接好，检查测砷仪的气密性 向样品及砷标准的锥形瓶中镉加入3mL KI，0.5mL 酸性SnCl2，混匀，静置15min，向样品中加入51
14、0滴辛醇后，于样品和标准中各加入锌粒，密闭于常温下反应45min。取下吸收管，加入三氯甲烷补足至5mL，用1cm比色皿，以吸收液调零，于波长520nm测定吸光值。,思考题,测砷仪导气口所使用的乙酸铅棉花的作用是什么？ 该方法测定无机砷含量比实际偏高，请就实验操作分析可能原因。 食品卫生标准中为什么要求无机砷限量？,酶联免疫吸附试验间接竞争法 测定抗生素氧氟沙星,实验要求,掌握酶联免疫吸附实验间接竞争法的实验原理及技术 酶标仪的使用 移液枪的使用 结果处理方法,实验原理,间接竞争法用于测定抗原： 将已知可溶性抗原吸附于载体，洗涤。洗涤的目的是为了去除未结合的抗原；加抗体和抗原，包被抗原与游离抗原
15、竞争结合抗体；洗涤；加酶标记的抗球蛋白抗体（抗抗体），使与抗原抗体复合物结合；洗涤；加酶作用底物，显色。样品中的游离抗原越多，竞争掉的抗体就会越多，最终的显色结果就会越浅。根据呈色的深浅进行定性或定量分析。,快速筛选检测技术,八十年代开始，免疫检测技术作为快速筛选检测方法得到了快速发展。酶联免疫（ELISA）等技术由于可以避免假阴性，适宜于阳性率较低的大量样品检测，在农兽药残留检测中应用日益增多。,反应板上包被的抗原,加入抗体,酶联免疫吸附试验 ELISA （enzyme-linked immunosorbent assay）,洗涤清除非特异性抗体,加入酶标抗抗体,加入反应底物,显色,酶联免疫
16、井酶标板,酶标仪,ELISA试验中的各个环节,（一）载体有聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球珠、醋酸纤维素膜等。用聚苯乙烯微量滴定板（40孔或96孔板）是目前最常用的ELISA方法，也是通常所说的ELISA方法。,（二）缓冲液,1.包被液：在碱性、低离子条件下，对蛋白吸附到载体上较好，一般采用pH 9.6的碳酸缓冲液。为不使溶液pH值降低，须密闭4保存，且一次配制应用期不超过一周。 2.稀释液：多采用含Tween-20的磷酸缓冲液（PBS pH 7.4）。临用前加1% BSA（小牛血清白蛋白）或小牛血清。Tween 20和1% BSA的作用是减少非特异性的结合。,3.洗涤液： PBS(pH 7.4
17、) 即不加 BSA 的稀释液来洗板。 4.底物溶液：常用的辣根过氧化物酶（HRP）所用的底物为磷苯二胺（OPD）+H2O2，或者四甲基联苯胺（TMB）。 底物缓冲液为pH 5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液。底物溶液一定要现用现配。 5.终止反应液：可用强酸或强碱溶液来终止反应。 一般为24mol/L H2SO4或3mol/L NaOH。,（三）包被,1.定义将抗原或抗体吸附于固相表面的过程，称载体的致敏或包被。各种蛋白质在固相载体表面的吸附能力不同，但大多数蛋白质可以吸附于载体表面。可溶性物质或蛋白质微粒的抗原较易包被上去。用于包被的抗原或抗体需纯化，纯化抗原或抗体是提高酶联免疫吸附试验敏感性与特
18、异性的关键。,2 包被条件 高pH和低离子强度缓冲液一般有利于蛋白质包被。 通常用0.1mol/L，pH 9.6 碳酸盐缓冲液作包被液。一般均在4过夜，也有经37 23小时达到最大反应强度。 包被后的滴定板贮于4冰箱，可贮存3周；真空塑料封口，于-20冰箱可贮存更长时间。 用时要充分洗涤。,（四）封板,用110%小牛血清/小牛血清白蛋白的缓冲液，封闭载体45分钟-1小时。目的：封闭未结合Ag/Ab的载体的其它部位。,(五) 洗涤,ELISA整个过程需进行多次洗涤。洗涤非常关键。 目的：为了除去未结合的Ag或Ab，因此洗涤必须充分，否则引起非特异性的吸附。洗液中含有吐温-20表面活性剂，帮助彻底
19、洗涤。 在洗涤过程特别注意防止串孔。洗涤液不要加的太满，尤其在加完待测的Ag或Ab时。 洗涤时，先将前次加入的溶液到空，甩干，然后加入洗液，震荡洗，洗3次，每次3分钟。倒干，并用滤纸吸干。,（六）底物显色,ELISA必须选用反应后的产物为水溶性色素的底物。最常用的是邻苯二胺（OPD）和 H2O2，产物呈棕色，可溶。也常用四甲基联苯胺（TMB）为供氢体，其产物为蓝色（加H2SO4后变蓝）测定波长为450nm。 底物显色以室温1020分钟为宜。反应结束每孔加浓硫酸50L，终止反应。,（七）结果判断,每批试验都需要阳性对照、阴性对照和空白对照。 用酶标仪ELISA专用的分光光度计测定。也称为酶联免疫
20、测定仪。测定光密度（OD值）波长随底物而异。 定性结果的判定，常用3种方法1）目测法，一般加底物作用后，肉眼观察颜色反应超过阴性对照，即判为阳性。2）以标本OD值（P）阴性对照OD值（N）2-3个标准差为阳性。3）以P/N值2.1为阳性，P/N值2.1而1.5可疑，P/N值1.5为阴性。,实验操作,1、包被反应板（包板）：取微量反应板，每孔加氧氟沙星抗原100L，4过夜。 2、洗涤：用PBST洗涤液加满孔洗涤三次，每次洗涤5分钟； 3、封闭：用0.1%的卵清蛋白封闭，每孔加满，37下孵育1.5 小时； 4、洗涤：用PBST洗涤液加满孔洗涤三次，每次洗涤5分钟； 5、检测：将待检的药物稀释成一定
21、的浓度梯度，与工作浓度的抗体按1：1混合后，每孔加入100L，37下孵育1.5 小时；,实验操作,6、洗涤：用PBST洗涤液加满孔洗涤三次，每次洗涤5分钟； 5、加酶标抗抗体：将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体稀释至工作浓度，每孔加入100L，37下孵育1 小时； 7、洗涤：用PBST洗涤液加满孔洗涤三次，每次洗涤5分钟； 8、加底物：将TMB底物配制成一定的浓度，每孔加入100L，37下闭光显色20分钟； 9、加终止液：每孔加入2M H2SO4 50L终止反应，于450nm测吸光值。,标准曲线的绘制以光密度（OD值）为纵坐标，以氧氟沙星标准溶液浓度的对数值为横坐标，绘制光密度值（OD值）与log浓度的关系曲线。,思考题,简述酶联免疫吸附试验在农兽药残留检测中的优势和缺点。 简述抗体的制备方法 洗涤操作非常关键，请简述其作用,
