1、显微鉴别实验准备：1.仪器：显微镜，镊子，解剖针，载玻片，盖玻片，酒精灯，单面刀片，粉碎机，绘图板，铅笔等。 2.试剂：水合氯醛试剂，甘油醋酸试液（斯氏液） ，稀甘油试剂，甘油-乙醇溶液，苏丹试液， 钌红试液， 间苯三酚试液，碘试液，硝铬酸试液，-萘酚试液，硝酸汞试液，氯化锌碘试液，不同浓度的乙醇溶液等。切片制作标本片 粉末制片 表面标本片 解离组织片 花粉粒与孢子制片 磨片制片常用制片方式：徒手切片，粉末制片、表面标本片：解离组织片：花粉粒与孢子制片：磨片：一、切片制作标本片 药材的预处理：先将药材表面泥沙刷洗干净，将应观察的部位，切成适当大小的块或段，一般以宽 1cm、长 3cm 为宜，切
2、面削平整。质地软硬适中的药材可直接进行切片；质地坚硬的则须先使其软化后再切片。徒手切片：在检验工作中，此法最常用，操作简便，迅速，制成的切片保持其细胞内含物的固有形态，便于进行各种显微化学反应观察。二、粉末制片：主要用于粉末状的药材及药材粉末制成的成方制剂观察。（1）粉末制备：药材要先干燥，磨或锉成细粉，装瓶，贴上标签。粉末制备时，注意取样的代表性，应注意各部位的全面性，例如：根要切取根头、根中段及根尾等部位，必须全部磨成粉，不得丢弃渣头。并需通过 4 号筛，混合均匀。干燥时，一般温度不能超过 60，避免经常受温，使淀粉糊化，难以观察其完整者。表面标本片：主要用于叶类、花类（萼片、花瓣） 、果
3、实、草质茎及鳞茎等药材的表面特征如毛茸、气孔、表皮细胞等的观察。质地菲薄的药材可以整体装片；较厚的药材则须撕下表皮然后装片。解离组织片：适用于厚壁组织或输导组织等的单个细胞的显微观察。将样品切成段（长约 5mm，粗约 2mm）或片（厚约 1mm） ，对于木类或茎类木质部，最好切成纵长的小段。然后根据细胞壁的性质，按照下列方法之一进行处理：如样品坚硬，木化组织罗多或集成较大群束，可用硝铬酸法或氯酸钾法；对于薄壁组织占大部分或分散存在的样品，可用氢氧化钾法。花粉粒与孢子制片：取花粉、花药（或小的花）或孢子囊群（干燥样品浸于冰醋酸中软化） ，用玻璃棒捣碎，纱布过滤，滤液置离心管中，离心，取沉淀加新鲜
4、配制的醋酐与硫酸（9：1）的混合液 13ml，置水浴上加热 23 分钟，离心，取沉淀，用水洗涤 2 次，加 50%甘油与 1% 苯酚 34 滴，用品红甘油胶封藏观察。也可直接用水合氯醛试液装片，具体操作同粉末标本片。磨片：凡需观察断面，以一般切片无法制作的标本，如坚硬的动物类药材珍珠、石决明、动物骨骼、矿物药等可采用磨片法制片。片的厚度一般为 2050m。磨片方法有手工制与机器磨制。中药成方制剂的鉴别：按剂型不同，分别将样品处理后，按粉末制片法装片观察。散剂、胶囊剂：可直接取出粉末装片或透化装片。片剂：可取 23 片研细后，取粉末适量装片或透化装片。水丸剂：可取数丸置乳钵中（若系包衣水丸，可刮
5、除包衣）研细，取粉末适量装片，或取粉末适量置小容器内，加水合氯醛液透化（加适量甘油以防水合氯醛结晶析出） ，搅匀，用吸管吸取混悬液装片。蜜丸剂：样品可用两种方法处理：用解剖刀沿蜜丸正中切开，从切面由外至内刮取少许样品，置载玻片中央偏右，滴加适宜的试液，用玻璃棒搅匀。按上述粉末制片法制片，或透化装片。将样品切碎放入容器，加水搅洗涤，然后置离心管中离心沉淀，如此反复以除尽蜂蜜后，取沉淀或透化后装片。含挥发性成分的制剂：取其粉末进行微量升华装片。粉末制片方法与操作：用解剖针挑取粉末少许，置载玻片的中央偏右的位置，加适宜的试液 1 滴，用针搅匀（如为酸或咸时应用细玻棒代替针） 。待液体渗入粉末时，用左
6、手食指怀拇指夹持盖玻片的边缘，使其左侧与药液层左侧接触，再用右手持小镊子或解剖针托住盖玻片的右侧，轻轻下放，则液体逐渐扩延充满盖玻片下方。如液体未充满盖玻片，应从空隙相对边缘滴加液体，以防产生气泡；若液体过多，用滤纸片吸去溢出的液体，最后在载玻片的左端贴上检品的标签或书写上标记。粉末制片的注意事项1. 洁净。粉碎用具用完后，必须处理干净，干燥后才能使用于另一种药材。盖玻片和载玻片应绝对干净。新片要用洗液浸泡或用肥皂水煮半小时取出，先用流水冲洗后，再用蒸馏水冲洗 12 次后，置于 70%90%乙醇中，备用。2.顺序。 显微鉴别实验时，应先观察淀粉粒（斯氏液） ） 、菊糖橙皮苷结晶（水合氯醛试液装
7、片不加热，观察水溶性内含物）等，再用水合氯醛试液加热透化，观察其他显微特征，用稀甘油装片观察糊粉粒。鉴别成方制剂前，应了解处方组成和制法，分析处方中各种饮片的主要鉴别特征及用量的多少。3.操作。粉末加液体搅拌及加盖玻片时容易产生气泡。如用水或甘油装片时，可先加少量乙醇使其润湿，可避免或减少气泡的形成，或反复将盖玻片沿一侧轻抬，亦可使多数气泡逸出。搅拌时产生的气泡可随时用针将其移出。装片用的液体如易挥发，应装片后立即观察。用水装片也较易蒸发而干涸，通常滴加少许甘油可延长保存时间。需用水合氯醛试液透化时，见气泡免同时离开火焰，待气泡停止逸出再放在小火上，并随时补充蒸发的试液，至粉末呈透明装为止，放
8、凉后滴加甘油镜检。 粉末药材制片时，每片取用量宜少不宜多，为使观察全面可多做些制片。如取量多，显微特征单一轮廓不清，反而费时，不易得出准确结论。 中成药制剂的粉末检查，因在多味药材粉末中寻找某一味药的某一显微特征，有时较难查见，可以取粉末量多些，置试管或小烧杯中，加入水合氯醛试液，加热透化。透化好后再用吸管吸出，滴在载玻片上，加盖玻片，即可观察。1、显微镜的使用 使用显微镜观察时， 应当注意两先两后，即先低倍、后高倍、先粗调、后微调。 2.目镜功物镜如有不洁时，要用擦镜纸作直线方向揩拭，切勿用手指或手帕及棉布涂擦。目镜或物镜如沾有油污，可先用擦镜纸沾上少许二甲苯（或无水乙醇和乙醚 11）擦拭干
9、净，再用干净擦镜纸揩拭一遍。3.使用前要清洁镜身和透镜，观察时一定要加盖玻片，同时不要让玻片上的水流到载物台上，更不要让酸、碱及其他化学药品接触显微镜，不要让显微镜在阳光下曝晒。 4、显微镜的维护 应特别注意防尘 、防潮与防腐。避免载玻片上滴加过多的液体试剂，避免试剂流出引起腐蚀。 5.不要用手触摸光学玻璃部分。6、显微测量法 鉴定药材粉末时， 一般需要采用显微长度测量的方法。长度的测量时，需要用 2 种标尺，即台测微尺与目测微尺（需要标化） 。1.放置玻片标本 将待镜检的玻片标本放置在载物台上，使其中材料正对通光孔中央。再用弹簧压片夹在玻片的两端，防止玻片标本移动。若为玻片移动器，则将玻片标
10、本卡入玻片移动器，然后调节玻片移动器，将材料移至正对通光孔中央的位置。2.低倍物镜观察 用显微镜观察标本时，应先用低倍物镜找到物像。因为低倍物镜观察范围大，较易找到物像，且易能找到需作精细观察的部位。其法如下：（1）转动粗调螺旋，用眼从侧面观望，使镜筒下降，直到低倍物镜距标本 0.5 厘米左右为度。（2）用手慢慢转动粗调螺旋，使镜筒渐渐上升，直到视野内的物像清晰为止。此后改用微调螺旋，稍加调节焦距，使物像最清晰。（3）用手前后左右轻轻移动玻片或调节玻片移动器，便可找到欲观察的部分。要注意视野中的物像为倒像，移动玻片时应向相反方向移动。3.高倍倍观察 在低倍观察基础上，若放大倍数不够，可进行高倍
11、观察。其方法如下：（1）将欲观察的部分，移至低倍镜视野正中央，物像要清晰。（2）旋转物镜转换器，使高倍物镜移到正确的位置上，随后稍为调节微动螺旋，即可使物像清晰。若使用某一种显微镜，对其性能尚不熟悉时，可按下述方法操作：在完成低倍观察后，稍微调高镜筒，把高倍物镜转换至工作位置上，然后从旁观察，小心地慢慢升高物镜寻找目标。防止物镜与标本相碰或沾上临时玻片旁的水或化学药品而损坏镜头。（3）轻轻移动玻片标本或调节玻片移动器，找到欲仔细观察的部位。使用高倍物镜时，由于物镜与标本之间距离很近，因此要特别仔细，也不能用粗调螺旋，而只能用微调螺旋。4.换片 观察完毕，如需换用另一玻片标片时，将物镜转回低倍，
12、取出玻片，再换新片，稍加调焦，即可观察。千万不可在高倍物镜下换片，以防损坏镜头。5.整理 显微镜使用结束后，升高镜筒，取下玻片标本，清洁显微镜，把物镜转离通光孔呈“八”字形，再下降镜筒至适当高度。如有玻片移动器，也要移适当位置，使物镜不会碰到。显微鉴定的记录1.组织特征的记录，应以从外至内的次序进行，对有鉴别意义的特征需详细地描述；一般应绘制简图。必要时，应利用显微描绘器或显微摄影装置绘制详图或提供显微照片，并注明放大倍数，或加比例尺。2.粉末显微鉴别时，先记录原粉末的色泽、气味。然后边观察、边记录。注意观察的全面性。观察每张粉末片时，应自上左至下右，呈“之”字形扫描，逐渐移动装片，全面观察目
13、的物，描述其特征，测量其长度，并注意统计最小量值、多见量值、最大量值。3.以先多数后少数的顺序描述特征，并标明“多见” 、 “少见” 、 “偶见” 。注意着重描述有鉴别意义的组织、细胞和内含物，对于各类药材和饮片均具有的一些基本组织，如叶类药材和饮片有栅栏细胞、海绵组织、细小导管等可不作重点描述。4.应注意标准规定以外的异常显微特征的记录，并根据药材和饮片的基原、成方制剂的处方和制法综合分析，必要时可采用对照药材或已经鉴定品种的药材为对照进行判断。TLC 法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观（分析结果以直观的彩色图像表达） ，适合国情，能有效、直观地反映药品的真实性、稳定性，现已成为中
14、药制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一，很快被用作定性和半定量的方法。影响薄层色谱展开效果的主要因素1.供试品溶液制备2.点样：薄层点样分为手工点样和点样器自动点样。手工点样简单、快捷，但展开效果与实验者的熟练程度有较大的关系；自动点样斑点均匀、大小一致、展开后效果较好，但仪器价格昂贵。在薄层色谱中，样品的用量对物质的分离效果有很大影响，样品的浓度应在样品的浓度应在 5 10 左右。所需样品的量与显色剂的灵敏度、吸附剂的种类、薄层的厚度均有关系。样品太少，斑点不清楚，难以观察，但样品量太多时往往出现斑点太大或拖尾现象，不易分开。一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边 10 15mm，高
15、效板一般基线距底边 8 10mm。圆点状直径一般不大于 3mm，高效板一般不大于 2mm，条带状宽度一般为 5 10mm，高效板一般为 4 8mm，可用专用半自动或自动点样器械点样，点样距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于 8mm，高效板供试品间隔不少于 5mm。点样量一般应控制在6ul 以下，否则样品斑点扩散，影响分离；样品量较低时，点样量可最大增加至 20ul。如果要重新点样，一定要等前一次点样残余的溶剂挥发后再点样，以免点样斑点过大。当使用高沸点溶剂如正丁醇时，点样后应将溶剂充分晾干，必要时可用电吹风吹干。点样时必须注意勿损伤薄层表面。3.薄层板：分为自制自制薄层板、市
16、售薄层板。根据固定相分为：常规薄层色谱法、高效薄层色谱法和反相键合相薄层色谱法。吸附剂含水量：与吸附剂的种类、使用时的加水量、风干时间、活化温度、活化时间等因素有关。硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺等。常用的有硅胶、氧化铝，它们的吸附性能好，适用于多种化合物的分离。硅胶是最常用的吸附剂，可用它来分离亲脂或亲水性物质。 吸附剂的选择：首先决定于样品成分的性质，即它们的溶解性、酸碱性、极性以及是否与吸附剂起化学反应等；其次要考虑吸附剂、载体是否容易得到及其价格等。常用的吸附剂厚度为 0.52.5mm，颗粒直径一般要求 1040um。 色谱板的尺寸一般为 10cm20cm 或10cm10cm。薄层厚度与
17、薄层板的尺寸限制了可以分离的样品量。1.0mm 厚的硅胶板最多可上样 5mgcm2。4.展开剂 流动相选择时需考虑溶剂的下列情况- 一些溶剂如氯仿、乙醚一般含有微量乙醇作保护剂，有时需重蒸除去乙醇。- 许多溶剂有吸湿性，使溶剂含水量不一致，导致实验难以重现。- 溶剂储藏时间和条件对溶剂质量影响，应注意出厂日期。- 混合流动相组分之间（或杂质）可能发生相互作用。- 对于易挥发的溶剂，难于配制稳定组成的流动相。要求操作格外小心，同时混合流动相不应重复使用。用乙醚或甲醇代替流动相中的一种较强组分，由于形成氢键可改善选择性。-若出现斑点拖尾，可向流动相中加少量水，或降低薄层活性，有利于改善分离。-对普
18、通酸性组分：特别是离解度较大的弱酸性组分应在展开剂中加入一定比例的酸，防止拖尾现象。-对于碱性物质：如某些生物碱，多数情况是选用氧化铝为吸附剂，选用中性溶剂为展开剂。若采用硅胶为吸附剂，则选用碱性展开剂为宜；但对某些碱性较弱的生物碱可使用中性展开剂。展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭，一般保持 1530 分钟。将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点 5mm 为宜，密闭。除另有规定外，一般常规薄层板上行展开 815cm，高效薄层板上行展开58cm。当溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测。（药典中收载的黄连生物碱薄层鉴别，展开剂为苯
19、-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试（6:3:1.5:0.5）如氨蒸气浓度不够，分离度明显降低；如展开前不用氨蒸气预平衡，则各生物碱斑点 Rf 值偏低，小檗碱，巴马汀均滞留在原点附近，难以分开。 ）5.温度：室温对分离影响不明显。其他条件相同，温度低比温度高时展开慢，分离好。较高温度展开时 Rf 值较高。温度对于薄层色谱的展开比纸色谱的影响要小，在吸附色谱上，温度从 20变到 40既不影响展开时间，也不影响 Rf 值，除有特殊规定外，薄层色谱的展开在室温进行即可。但有些成分的分离对温度较为敏感。在不结冻前提下，温度越低分离效果越好。6.湿度：硅胶薄层板吸附水蒸气的速度很快，0.25mm 厚、202
20、0cm的薄层板在 50%相对湿度中约 3 分钟就失去活性的一半，而 15 分钟时吸附的水分已达到最大值，因此，点样速度的快慢，空气相对湿度的大小，都可以影响分离以及重现性。7.显色：展开完毕后，把薄层从层析缸中取出，用铅笔划或小针刺出展开剂前缘的位置，随即进行显色，以确定各个斑点的位置、Rf值和显色情况，从而判断试样中含有哪些组分。有色物质经展开后呈现明显的色斑，很易判断。 对于无色物质，可根据化合物的性质，用物理检出法、化学检出法、酶与生物检出法和放射性检出法进行显色。显色装置 喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出，浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展
21、开缸代用。 检视装置 为装有可见光、254nm 及 365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱。薄层色谱中斑点异常：拖尾现象，边缘效应，S 形及波形斑点，念珠状斑点，斑点与对照品对不上等。1. 拖尾现象产生的原因：点样量过载（任何吸附剂负载化合物的能力都是有一定限度的点样量超载后，过载的化合物被抛在后面，就形成了拖尾。点样量如果很大时，可以点样使呈条带状，或者选择稍微厚一点的板） ，点样原点未重合（点样上下圆心没在没有重合，致使原点呈椭圆形，所以点样时位置要准确，可以预先设计好点样位置，用铅笔做一下笔记，每次点样对准圆点） ，展开剂（主要是展开剂的极性不适，展开剂配制是不够准确，需要饱和未饱和，
22、需要分层未分层等，准确配置，适当时可以加入拖尾抑制剂，少量酸或碱等） ，薄层板（使用适当的薄层板，有特殊要求的薄层板如要求使用 1%氢氧化钠板的情况下，使用一般的板层板，分离效果肯定不好，可以采用浸板的方法改进板性）等原因。2. 边缘效应：一般在薄层色谱中，薄层板两边展开剂跑得比较快，使得展开前沿形成一道弧线，称为边缘效应。边缘效应的产生是由于溶剂的挥发造成的.展开剂一般是由几个有机溶剂混合而成的,而在薄层板上一般是边缘上的展开剂较容易挥发,如果这几个有机溶剂的挥发性能差异比较大,那么就会造成薄层板上边缘和中间展开剂比例的差异而产生展开速度不一致的现象.如果展开前能充分饱和,那么展开过程中展开
23、剂挥发就会减少,从而减小边缘效应.还有就是薄层板不均匀也可以引起边缘效应，一般薄层板的边缘会薄一些，所以我们在点样的时候尽可能不要点在边缘位置上。展开剂要尽可能的饱和。3. S 形及波形斑点：一般都是因为薄层板不均匀引起的，同上要求点样时注意。4.念珠状斑点：化合物之间的距离较小，相互连接呈念珠状，也就是分离效果不好，样品成分过多，在一定长的薄层板上，排列不开，彼此重合，可适当增加薄层板的长度，使斑点间的距离增大多次点样时，点样中心不重合，形成复斑，多次点样，点样中心位置要准确，特别是无色斑点。5. 斑点与对照品对不上：点样时间上的差异，导致各斑点所含的水分不一样，在展开板上及展开剂中的吸附及溶解上不一致。各斑点的浓度差异，操作过程中，吹风机使用，使斑点间与固定相结合的程度不一样。记录 应包括仪器型号、编号，所用对照品或对照药材的批号，来源，有条件可以用相机直接拍下薄层照片附在原始记录单上。斑点大小与原始斑点大小应 一致 。
