生物化学大实验讲稿.doc

1、1生物化学大实验讲稿-离心分离血浆脂蛋白原理:本实验采用正常人抗凝血浆，以 NaBr 为密度介质，利用各脂蛋白颗粒密度不同，经过等密度超速离心大量制备低密度血浆脂蛋白。操作步骤 1血浆准备：取血库血浆 250mL 2CM 和 VLDL 分离：血浆中加入适量的双蒸水，调节密度至 1.019g/ml，分置于离心管中，加盖，用 1.019g/ml 密度液平衡，放入 RP-50T 转头，在 8下 40，000rpm 离心 20 小时。CM 和 VLDL 浮于离心管上层，用吸管小心吸取。3LDL 分离：下层溶液中加入适量的 NaBr，调节密度至 1.060g/ml，分置于离心管中，加盖，用 1.060g

2、/ml 密度液平衡，放入 RP-50T 转头，在 8下40，000rpm 离心,离心 24 小时。LDL 浮于离心管上层，用吸管小心吸取。4透析：已分离好的各部分脂蛋白含有大量的 NaBr，需要透析脱盐。将各脂蛋白溶液分别装入透析袋中，对抗 0.01mol/L PBS（pH7.4）溶液透析过夜。5浓缩：将透析过夜的脂蛋白溶液连同透析袋一起放入盛有 40%的 PEG20000的烧杯中，浓缩至适当体积。2详细操作步骤： 1血浆准备：取血库血浆 250mL ，提前一天放入冰箱 4冷藏2CM 和 VLDL 分离：1）取约 250ml 血浆置于 250ml 量筒中，加入适量的双蒸水（放入密度计时液体离量

3、筒管口约 1 厘米） ，调节密度至 1.019g/mL， （比重计 1.0001.1000）分置于 8 个离心管中，加液体离管口 58 mm,盖好盖子，并在相关器械内（盖盖子器）检查是否盖好，如盖好，则用注射器加入调好的血浆（密度1.019g/mL） ，加满，小螺丝盖好（稍松） ，大螺帽适紧。将 8 支离心管两两平均分成 4 组，置于天平上平衡，两两调平衡后，盖好小螺帽（小螺帽有阻力就行） ，试管标记编号。2）将离心管两两对应放入角度转头 RT-50T 内，注意在橡胶密封圈上涂油脂。3）输入离心数据，编离心程序：离心机显示屏上有速度、时间、温度、加速、减速及功能设定，上面为实际的，下面为设定的

4、。可根据自己的要求设定相关的参数。我们设温度在8，转速 40000rpm，离心时间 2023 小时，加速为 9，减速为 9。 功能 function 的设定有六个方面，常用的有 RLM，键入 enter 则显示不同的转子，上下键选定自己要用转子，向下选出 RP50T，键入 enter，显示转动还是创建或改变，还有删除,按自己需求设定，选出 1.runing,再次键入 enter，则屏幕下方显示你设定的转子，共转了多少转。我们可看到 RP50T 共转了多少转。4）在记录本上记录此转子总体使用的转数及时间。并记录其他相关信息。如姓名，年、月、日等等。5)装转子，特别注意垂直放入，轻轻上下提几下，不

5、要蹩着，看是否放好，切记：未放好则不要随意转动。6）盖好离心机盖子，键入 START,观察三项指标：真空的三个三角号是否达到。 （先抽真空， vacuum 为一个，速度可达4000 转/分，accelerate 变为 wait 等待符号，继续抽真空达两个号，则又出现 accelerate，速度进一步加速到 40000 转/分，再等十几分钟，则 vacuum出现三个。 ）3温度是否逐渐降下来。转速是否到达设定的转速。并注意听有无异常的声音，如有则键入 stop,查找原因。一般三项指标正常后再离开。7）二日，离心机停下，按 vacuum 键进气，打开离心机腔体盖子，垂直提出转子。用小锣丝刀斜提试管

6、从转子内取出。8）取盖子时一手握着试管，另一只手向上提盖子，一只手顶着另一只手，一定小心，慢慢将盖子取掉。9）CM 和 VLDL 浮于离心管上层，发白的不透明乳液，用胶头滴管小心吸取，置于锥形瓶中密封保存（标记日期、样本名称-VLDL，4冷藏，全部实验结束后，用塑料瓶冷冻保存） 。3LDL 分离：1）将 8 个离心管中的下层溶液取出，用滴管吸取离出的下清液多次清洗试管，将下层全部液体倒入烧杯中，加入磁子置于磁力搅拌器上混合均匀，将离心出来的下层不溶液体化开，然后将液体全部倒入 250ml 量筒中，加入适量的双蒸水（放入密度计时液体离量筒管口约 1 厘米） ，用药勺取适量的 NaBr 加入，将调

7、节密度至 1.063g/mL，分装液体至 8 只试管，加液体离管口约 58 mm,盖好盖子，并在相关器械内（盖盖子器）检查是否盖好。如盖好则用注射器加入调好的血浆（密度 1.063g/mL） ，加满，小螺丝盖好（稍松） ，大螺帽适紧， 。将 8支离心管平均分成 4 组，置于平衡天平上，两两调平衡，然后盖好小螺帽（小螺帽有阻力就行） ，试管标记编号。2）用筷子夹着脱脂棉将离心机转子内的冷凝水沾干，然后将油脂少许涂于密封橡胶圈，将转子准备好。3）将离心管两两对应放入角度转头后 RT-50T，其他操作同前，设定 在 8，40000rpm，离心 2023 小时，加速为 9，减速为 9，并选定 RT-5

8、0T 转子。注意放转子时垂直上下放，稍微提几下，不要蹩着转子，然后记录本上记录。4）三日，离心机停下，按 vacuum 键，进气，打开离心机腔体盖子，垂直提出转子。用小锣丝刀斜提试管从转子内取出试管。LDL 浮于离心管上层，为发黄液体，用胶头滴管小心吸取，置于烧杯中。等待浓缩及透析。 5）将 8 个离心管中的下层液体倒入锥形瓶中，密封保存（标记日期、样本名4称-LDL，4冷藏，全部实验结束后，用塑料瓶冷冻保存） 。4透析，已分离出来的 LDL 含有大量的 NaBr，需要透析脱盐，将 LDL 溶液装入 3 个透析袋中，用蒸馏水透析脱盐 6h，每 2h 换透析液一次。5 浓缩，经透析后的 LDL

9、溶液连同透析袋一起放入 40%的聚乙二醇PEG20000 的烧杯中浓缩至 68ml。注意：全部离心完成后，将离心机转子按前面进行操作，沾干管腔内的冷凝水，将油脂少许涂于密封橡胶圈，将离心机转子放于柜子中。并将离心机密封圈涂油脂，腔体用丝布擦干净，关机。离心技术： 离心技术在生物科学，特别是在生物化学和分子生物学研究领域，已得到十分广泛的应用，每个生物化学和分子生物学实验室都要装备多种型式的离心机。离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质

10、量、大小和密度。1基本原理当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即： F = ma = m 2 ra 粒子旋转的加速度， m 沉降粒子的有效质量，粒子旋转的角速度， r粒子的旋转半径( cm )。通常离心力常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离心力 “ RCF ”。或者用数字乘“g”来表示，例如 25000g，则表示相对离心力为 25000。相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”（980cm/sec2） ，此时“RCF”相对离心力可用下式计算：RCF = ma/ mg= a/ g9802rRC

11、F602rpm 5 RCF = 1.119105(rpm) 2 r ( rpm revolutions per minute 每分钟转数，r/min )由上式可见，只要给出旋转半径 r，则 RCF 和 rpm 之间可以相互换算。但是由于转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算是规定旋转半径均用平均半径“rav”代替： rav=( r minrmax) / 2r 的测量如下图所示：34rmin旋转轴 ravrmax 一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g” 表示。计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转

12、轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。因此在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“g”代替每分钟转数“rpm”，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均值（RCFa v） ，即离心管中点的离心力。为便于进行转速和相对离心力之间的换算，Dole 和 Cotzias 利用 RCF的计算公式，制作了转速“rpm” 、相对离心力“RCF”和旋转半径“r”三者关6系的列线图，图式法比公式计算法方便（列线图参见附录） 。换算时，先在 r标尺上取已知的半径和在 rpm 标尺上取已知的离心机转数，然后将这

13、两点间划一条直线，与图中 RCF 标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。注意，若已知的转数值处于 rpm 标尺的右边，则应读取 RCF 标尺右边的数值，转数值处于 rpm 标尺左边，则应读取 RCF 标尺左边的数值。2离心机的主要构造和类型离心机可分为工业用离心机和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性离心机和分析性离心机，制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离的样品容量比较大，分析性离心机一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测） ，能推断物质的纯度、形状和分子量等。分析性离7心机都是超速离心机。1）

14、. 制备性离心机可分为三类： 普通离心机：最大转速 6000 rpm 左右，最大相对离心力近6000g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。这种离心机多用交流整流子电动机驱动，电机的碳刷易磨损，转速是用电压调压器调节，起动电流大，速度升降不均匀，一般转头是置于一个硬质钢轴上，因此精确地平衡离心管及内容物就极为重要，否则会损坏离心机。 高速冷冻离心机：最大转速为 2000025000rpm（r/min） ，最大相对离心力为 89000g，最大容量可达 3 升，分离形

15、式也是固液沉降分离，转头配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在 040C，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显示，通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。 超速离心机：转速可达 5000080000 rpm，相对离心力最大可达510000g，最著名的生产厂商有美国的贝克曼公司和日本的日立公司等，离心容量由几十毫升至 2 升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区

16、带分离，离心管平衡允许的误差要小于 0.1 克。超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。超速离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。超速离心机的驱动装置是由水冷或风冷电动机通过精密齿轮箱或皮带变速，或直接用变频感应电机驱动，并由微机进行控制，由于驱动轴的直径较细，因而在旋转时此细轴可有一定的弹性弯曲，以适应转头轻度的不平衡，而不致于引起震动或转轴损伤，除速度控制系统外，还有一个过速保护系统，以防止转速超过转头最大规定转速而引起转头的撕裂或爆炸，为此，离心腔用能承受此

17、种爆炸的装甲钢板密闭。8温度控制是由安装在转头下面的红外线射量感受器直接并连续监测离心腔的温度，以保证更准确更灵敏的温度调控，这种红外线温控比高速离心机的热电偶控制装置更敏感，更准确。超速离心机装有真空系统，这是它与高速离心机的主要区别。离心机的速度在 2000 rpm 以下时，空气与旋转转头之间的磨擦只产生少量的热，速度超过 20000 rpm 时，由磨擦产生的热量显著增大，当速度在 40000 rpm 以上时，由磨擦产生的热量就成为严重问题，为此，将离心腔密封，并由机械泵和扩散泵串联工作的真空泵系统抽成真空，温度的变化容易控制，磨擦力很小，这样才能达到所需的超高转速。2）. 转头： （1）

18、转头：角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完整的金属制成的，其上有 412 个装离心管用的机制孔穴，即离心管腔，孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在 2040 度之间，角度越大沉降越结实，分离效果越好。这种转头的优点是具有较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长，颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应” ，壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱，影响分离效果。（2） 荡平式转头：这种转头是由吊着的 4 或 6 个自由活动的吊桶（离心套管）构成。当转头静止时，吊桶垂直悬挂，当转头转速达到每分钟 2009到

19、 800 转时，吊桶荡至水平位置，这种转头最适合做密度梯度区带离心，其优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，而不像角式转头中样品沉淀物的界面与离心管成一定角度，因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。其缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。（3）垂直转头：其离心管是垂直放置，样品颗粒的沉降距离最短，离心所需时间也短，适合用于密度梯度区带离心，离心结束后液面和样品区带要作九十度转向，因而降速要慢。103）. 离心管：离心管主要用塑料和不锈钢制成，塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE） ，聚碳酸酯（PC） ，聚丙烯（PP）等，其中 PP 管性能较好

20、。塑料离心管的优点是透明（或半透明） ，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用： 防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。防止样品挥发。支持离心管，防止离心管变形。3 .制备性超速离心的分离方法：1)差速沉降离心法： 这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离11心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分

21、离沉降系数相差较大的颗粒。差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过 23 次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯

22、颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活。122) 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是：分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是：离心时间较长；需要制备惰性梯度介质溶液；操作严格，不易掌握。密度梯度区带离心法又可分为两种： 差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速

23、沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差） 。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。13速率区带离心法是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl 等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。离心后在近旋转轴处(X 1)的介质密度最小，离旋转轴最远处(X 2)介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即 p m。这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。梯度液在离

24、心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。由于 p m可知 S0，因此该离心法的离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到沉淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部，离心时间不足，样品还没有分离。由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。常用的梯度液有Ficoll、Percoll 及蔗糖。等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度，这就是预形

25、成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密14度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，即 p m时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即 p = m时，dx/dt 为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。离心时，

26、样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝 CSCl，其密度可达 1.7 g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器

27、等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。收集区带的方法有许多种，例如：15（1） 用注射器和滴管由离心管上部吸出。（2） 有针刺穿离心管底部滴出。（3） 用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。（4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。4 梯度溶液的制备1） 梯度材料的选择原则 理想梯度材料具备的特点：化学稳定性好，与被分离的生物材料不发生反应，对被分离样品渗透很少，且易与所分离的生物粒子分开。溶解度高，可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和 pH 变化较小。不会对离心设备发生腐蚀

28、作用。容易纯化，价格便宜或容易回收。较低的光吸收特性，有光折射率的对照资料，浓度便于测定。物理性质、热力学性质应该是已知的。但很难找到一种适合于各种密度梯度离心的完美梯度液。2）基本符合原则的梯度材料：糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll） 、右旋糖酐、糖原无机盐类：CsCl、RbCl（氯化铷） 、NaCl、KBr 等有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等硅溶胶：如 Percoll蛋白质：如牛血清白蛋白重水非水溶性有机物：如氟代碳等163）梯度材料的应用范围 蔗糖：水溶性大，性质稳定，其最高密度 1.33g/ml，价格低易制备。但渗透压较高，高浓度时粘度较大。线性梯度范围

29、是 520%W/V 或1040%W/V。用于细胞器、病毒、RNA 分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，以及较高的渗透性，不宜用于细胞的分离聚蔗糖：商品名 Ficoll，常采用 Ficoll-400（相对分子重量 400000） ，Ficoll 渗透压低，而粘度特别高，与泛影葡胺混合可降低粘度。用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。 CsCl：为离子性介质、水溶性大，最高密度可达 1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，用于 DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。 卤化盐类：KBr 和 NaCl 可用于脂蛋白分离，KI 和 NaI

30、 可用于 RNA 分离，其分辨率高于铯盐。NaCl 梯度也可用于分离脂蛋白，NaI 梯度可分离天然或变性的 DNA。Percoll：商品名，是一种 SiO2 胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP） ，渗透压低，不穿透生物膜，对细胞无毒害，对生物材料的影响小，颗粒稳定。在冷却和冻融情况下稳定，粘度高，在酸性 pH 和高离子强度下不稳定。用于细胞、细胞器和病毒的分离。蔗糖适宜做速率区带离心的材料，而等密度离心，不同的生物样品对梯度17材料的要求有较大差异。 较 好较 好最 佳最 佳最 佳可 用可 用Nycodenz 可 用较 好较 好可 用差差差Percol 较 好差差差最 佳较 好最 佳Csl较

31、 好最 佳可 用可 用不 适 合差差Ficol 较 好可 用较 好较 好可 用差差蔗 糖 病 毒细 胞亚 细 胞 器膜核 蛋 白RNADNA材 料 名 称常 用 于 等 密 度 离 心 梯 度 材 料4）密度梯度液可用梯度仪制备线性梯度，也可人工辅设阶梯型梯度，离心管静置一定时间后也可以形成近线性梯度。（1）阶梯型不连续梯度多适用于从组织的匀浆中分离整细胞或亚细胞器，或用于某些病毒的纯化。 连续梯度由于其密度平滑地变化，多用于某些生物样品的多种成份组合的分离。（2）选择自形成梯度还是预形成梯度，主要取决于材料的性质。如果些胶体硅材料（Percoll 或 Ludox）可在 1000020000g

32、 的离心场中离心 30min 就可以自形成梯度。但 CsCl 或 Meterizamide 需要 50000500000g 的离心场中离心数少时甚至数十小时才能自形成梯度。如用 CsCl 做质粒 DNA 分离，梯度液中加 EB 和Triton x-100，在 490000g 需要离心 4hr，才能利用 CsCl 的自形成梯度分离出质粒 DNA，染色体 DNA，RNA 和蛋白质。（3）预形成梯度的优点是离心时间较短，因为只要考虑样品中某个组份到达其等密度区所需要的时间。预形成梯度常被用来分离较大颗粒，如100S 的样品。预形成梯度缺点是被分离样品的容量较少；对某些样品如细胞或病毒会因单向沉降而产

33、生颗粒聚结，从而减少了样品回收率和纯度；预先制备样度液需较长时间，较繁复。(4)自形成梯度：某些梯度材料能够在离心过程中形成密度梯度，Ludox、Percoll 中的胶体硅颗粒可较快地形成梯度，而另一些材料如CsCl、Cs2SO4 和 Metrizamide 等则在沉降过程中受到其反向浓度扩散的影响，达18到平衡的时间就比较长。如果为了提高分辨率，自形成梯度是很难使梯度曲线变得陡一些。5.离心操作的注意事项：一般离心机使用注意事项：高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵

34、守操作规程。1) 使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。2) 装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干

35、，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。3) 若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。4) 离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。5) 每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。 注、各种仪器的使用注意事项（一）高速冷冻离心机1. 未经过培训和

36、考核者不能使用。2. 选择合适的转头和转速，绝不可超速使用。193. 选择合适的温度，通常 4，除有机溶剂外不要低于零下，以免冰冻，损坏离心管和转头。4. 转头使用前必须用擦孔棒将管孔擦净，并仔细检查有无裂痕和孔底白斑。若有，转头报废。5. 离心管内装载的溶液量必须合适，不锈钢管无盖，只能装 23，塑料管可装至“肩”部。管盖必须盖严绝不允许漏液。空管离心会变形。塑料管使用有机溶剂必须符合规定。6. 离心管必须成对或成形放置，必须严格平衡，偏差0.1g。7. 不允许无转头空转，放取转头必须用手柄，以防转头滑落。转头要轻放、卡稳，旋下手柄时要用手扶住手柄只转转头。转头盖要盖严，无盖不准离心。8.

37、离心时不准打开机盖，不准扒扶在离心机上，如有异常声音和振动时立即停机。9. 转头使用后必须及时由转头室中取出、擦干，用擦孔棒将管孔仔细擦净。如有溶液溢出必须清洗干净，擦净转头室内凝水，开门凉干转头室。10. 使用离心机必须予约，用后必须登记。（二）普通离心机1.离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。2.离心管必须仔细平衡。3. 机内若不清洁，离心管要用塑料薄膜封口。4. 必须慢起动，然后加速。5. 离心时不准开盖。6. 不准用手刹车。（三）超速离心机使用注意事项：1) 超速离心机由专人保管专人使用，非保管人员严禁擅自操作。2) 离心管要对称同量、同液、满管放置，严禁半管和空管运转。3) 送样人

38、要向操作者说明所离心的溶液是何种溶液，操作者要作详细记录。4) 运行前首先要平衡转头所需温度，致冷或保温。5) 转头放置要规范、轻放，放好后轻转转头，有速度显示才可正式运转。6) 关、开离心机的门要轻，防止仪器移位，影响水平。7) 离心后将离心管、转头、腔体擦洗干净，规范存放。20超速离心机使用操作规程：1)安装离心管帽，角转管帽螺纹上涂润滑脂，密封圈上不能涂真空脂，水平转套管的螺 纹要涂润滑脂，密封圈上要涂真空脂。2)离心管同样、同液、满管对称放置。3)盖好转头盖，安装转头。4)确信安装稳妥后，关门，开机。5)设置参数：设置速度按 SPEED 键，输入参数，按 ENTER 键，同样设置时间和温度。6)运行状态下可以改变程序运行，所以首先设置低速，然后逐渐升高速度，确保安全。7) 按 VACCUM 键抽气，按 START 键8) 速度显示为零后，按 VACCUM 键放气，打开门，取出转头。9) 清洗转头和离心管，擦洗腔体。10)关门，按 VACCUM 键抽气，关电源。