1、理学院School of Sciences光谱分析学生姓名：何霞学生学号：200801173所在班级：应用物理学 081 班所在专业：应用物理学分子吸收光谱在生物大分子研究中的应用摘 要 ：综述了近年来分子吸收光谱法在生物大分子结构研究中的应用, 重点介绍了利用分子吸收光谱法研究蛋白质、核酸结构及其与小分子的相互作用。分子吸收光谱法因其简便、快速的特点而广泛应用于生物大分子结构的测定。紫外光谱法常用于从分子水平上研究小分子如抗癌药物与核酸作用的机理, 并应用于小分子作为光谱探针测定蛋白质、核酸构象的变化。傅里叶变换红外光谱法主要应用于蛋白质二级结构的测定, 运用傅里叶自卷积将重叠的酰胺带进行处
2、理, 获取蛋白质二级结构的含量信息, 从而使傅里叶变换红外光谱法成为揭示蛋白质构象变化的重要工具。关键词： 分子吸收光谱; 紫外光谱; 红外光谱; 蛋白质; 核酸引 言生物大分子的功能往往是由其结构所决定的, 生物大分子结构与功能的研究是生命科学的核心课题。随着当代科学技术的发展, 对生物大分子的研究已经从一般描述性的科学过渡到探讨其具体化学结构的分子水平的科学。其中蛋白质与核酸是生物大分子中的两大组成部分, 它们直接涉及到生命科学的许多核心内容, 所以对蛋白质和核酸的研究一直是生物大分子研究中最受关注的热点。著名科学家Freder ickSanger 教授因先后发展了蛋白质及核酸的测序方法,
3、 1958年和1980 年两次获得诺贝尔奖。2002 年诺贝尔化学奖授予了科学家John B1 Fenn, Koichi Tanaka 和Kurt W thrich, 以表彰他们在生物大分子结构确定和分析研究领域所发展的质谱以及核磁共振新方法。无论是蛋白质还是核酸的研究, 都极大地带动了有关的研究方法及手段, 其中分子吸收光谱法因其快速、简便而越来越多地应用于生物大分子的研究。早在20 世纪30 年代, 对分子间弱相互作用力进行了大量的研究, 而在此后的很长一段时间内对它的研究进展缓慢。近年来, 随着超分子化学研究的深入, 对其分子间弱相互作用本质的研究引起世界科学界的极大关注。一般认为,分子
4、间的弱相互作用力主要有范德华力 1、氢键 2 作用以及堆砌作用力 3等几种形式。研究分子间弱相互作用的手段主要包括X 晶体衍射、核磁共振、质谱、圆二色谱、荧光光谱以及分子吸收光谱法。分子吸收光谱包括紫外光谱和红外光谱, 本文主要介绍分子吸收光谱在生物大分子结构研究中的应用, 重点介绍利用分子吸收光谱法研究蛋白质以及核酸分子和小分子的弱相互作用。1 紫外光谱法在生物大分子研究中的应用111 紫外光谱法研究蛋白质的结构变化蛋白质是一类重要的生物大分子, 不同的蛋白质具有各种不同的生理功能, 它的结构单元是A2 氨基酸。常见的20种A2氨基酸中只有芳香族氨基酸, 如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和含硫氨基
5、酸, 在230 310 nm 波长范围内有吸收, 因此利用紫外光谱法可以考察芳香族氨基酸的残基在蛋白质分子中的位置( 即表面和内部) 、环境及数量, 以及在物理和化学因素的影响下, 蛋白质二、三级结构的变化。蛋白质的紫外吸收光谱中, 一般210 nm 处的峰是肽键的强吸收峰, 280nm 处的峰是酪氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸残基中共轭双键的吸收峰。利用各种技术研究蛋白质与配体之间的相互作用及动力学过程, 对于解释蛋白质结构与功能的关系及蛋白质与各种配体的作用机制具有重要的意义。若小分子配体与生物大分子结合前后的吸收光谱有一定差异时, 可以在不经分离的情况下用分子吸收光谱研究配体与蛋白质分子的相互
6、作用。白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质, 它在人体内起着重要的储存和运输作用, 它可与许多内源和外源蛋白质结合, 因此目前对白蛋白与其他小分子的相互作用开展了广泛的研究。王亚俐等 4 利用光谱法研究了苯甲酸钠与牛血清蛋白( BSA) 的体外相互作用。苯甲酸钠的加入使得BSA 紫外吸收光谱中210 nm 处的峰值逐渐降低, 峰位红移。研究表明, 苯甲酸钠的加入使BSA 主链构象发生变化, 即螺旋结构变松散。朱兵等 5 利用紫外示差光谱法对稀土离子与乳铁蛋白的结合进行了研究, 结果表明, Tb3+ 与Eu3+ 可特异性地结合在脱铁乳铁蛋白的两个Fe3+ 结合部位, 但并不能从已经结合铁的乳铁蛋白中把铁
7、置换出来。周妍娇等 6 利用紫外光谱以及圆二色谱对金属硫蛋白及其结构域突变体进行了研究,结果表明, 结构域之间存在相互作用, 并且影响其与金属离子的结合。魏晓芳等 7 利用紫外光谱研究了pH 21 3 111 3的范围内牛血清蛋白(BSA) 芳香氨基酸残基微环境的变化,结果表明, 碱诱导蛋白质分子空间构象充分伸展, 将更多的疏水性氨基酸残基暴露于溶剂中。蛋白质的定量所使用的方法多种多样, 其中用小分子作为光谱探针测定蛋白质以其简便、灵敏等优点而被广泛应用。如染料探针可用于辨别蛋白质分子中氨基的状态、蛋白质分子的活性区, 可检测pmol 级的蛋白质; 稀土离子探针可用于研究蛋白质分子与金属离子结
8、合部位的结构类型, 给出蛋白质分子构象及构象动力学信息。目前利用紫外光谱法对蛋白质与探针小分子的作用机制开展了广泛的研究 8217。胡秋娈等 8 利用光谱法研究了牛血清蛋白与硝酸偶氮的反应。在硝酸偶氮体系加入BSA 后, 硝酸偶氮的光谱特征变化表明, 硝酸偶氮和BSA 生成了非共价键复合物, 带负电荷的硝酸偶氮与带正电荷的蛋白质分子主要以静电引力结合。李娜 10、魏永巨等 11也利用紫外分光光度法对偶氮类染料与蛋白质的相互作用进行了研究, 对二者的作用机制有了进一步的认识和了解。蛋白质吸光探针尽管研究得较早, 已得到广泛的应用, 但是, 这类探针反应的作用机理迄今仍不很清楚, 即对于光谱探针小
9、分子和蛋白质分子的相互作用的了解并不是太透彻。所以深入开展蛋白质的光谱探针理论研究,对于深刻理解其反应实质, 实现从感性认识到理性认识的飞跃, 指导改进蛋白质的分析方法, 实现与生命科学、临床医学的发展相适应, 均有着重要的意义。112 紫外光谱法研究小分子和DNA 的相互作用核酸是又一类重要生物化学物质, 核酸的碱基对中储存着遗传信息, 这些信息与生物体的生长、发育等正常生命活动以及癌变、突变等异常生命活动有关。从研究抗癌药物和核酸之间的相互作用入手, 为寻找新型抗癌药物、合理改善药效、降低抗癌药物的毒性提供理论依据。现在普遍认为药物分子与核酸的弱相互作用包括静电结合、沟渠结合和嵌插作用3
10、种方式 18219。药物分子镶嵌或嵌插于DNA 螺旋沟或碱基中, 或以静电引力作用于磷酸骨架, 阻碍DNA 信息的正常表达, 达到对细菌或癌变细胞生长、繁殖的破坏。目前从分子水平上研究抗癌药物与核酸作用机理的报道很多, 大多采用荧光、紫外、循环伏安、圆二色谱、共振光散射、核磁共振谱等手段, 其中紫外光谱法以其快速简便发挥着重要的作用。具有双螺旋结构的DNA 分子由于含有芳香性碱基和磷酸生色基团, 使其在260 nm 左右有一强吸收峰。由于DNA的碱基是许多药物与之结合的位点, 结合药物后会导致上述特征吸收峰的位移, 因而在DNA 溶液中加入很少量的化合物,观察DNA 特征吸收峰是否发生位移可粗
11、略知道化合物是否与DNA 发生了作用, 例如增色、减色效应是DNA 特有的与其双螺旋结构密切相关的光谱性质。盐类阳离子可与DNA 骨架磷酸基团结合使DNA 收缩而产生减色效应, 酸碱可与DNA 碱基发生作用破坏DNA 的双螺旋而产生增色效应, 当然该方法还存在过检现象。一般而言, 化合物与DNA发生作用后必然会在电子吸收光谱上有所表现, 反之则不一定成立。卟啉类化合物在生命体系中的催化、载氧、免疫反应及蛋白质合成等许多生物化学过程中, 都起着重要的作用, 水溶性卟啉及金属卟啉化合物的生物活性已日益引起人们的注意, 研究表明: 阳离子型卟啉及其金属化合物不仅具有抗病毒、抗细菌的活性, 而且在癌症
12、与肿瘤的光动力学疗法中具有诱人的前景。刘杰等利用紫外光谱法研究了卟啉化合物与小牛胸腺DNA 的相互作用。卟啉化合物与DNA 相互作用后, 均使其吸收带出现了明显的减色和红移, 进一步研究表明, 不同类型的卟啉化合物与小牛胸腺DNA 产生了不同的结合方式。黄承志 22 等也利用紫外光谱法对不同取代基的卟啉化合物和核酸的作用机理进行了详细的探讨。二氯二茂铁是一种活性很高的抗肿瘤药物, 但对它的抗肿瘤机理目前仍无定论。张志刚等利用紫外光谱法研究了二茂铁二甘氨酸盐酸盐与DNA 作用机理。结果显示, 二茂铁二甘氨酸盐酸盐与DNA 有强烈的成键作用, 并且由实验现象推断药物与DNA 形成了摩尔比为1B1
13、的加合物。卢继新等利用紫外光谱法研究了金属离子存在下52氟尿嘧啶( 52FU) 与脱氧核糖核酸的相互作用, 结果表明, 52FU 的加入使DNA 的紫外吸收光谱发生了明显的变化, 进一步研究表明52FU 与DNA 为双螺旋结合, 而对DNA 构象没有显著的影响。卢继新等还利用紫外光谱法研究了巯嘌呤金属配合物与小牛胸腺DNA 的作用。结果表明巯嘌呤可能与DNA 骨架磷酸基团结合, 且巯嘌呤与金属离子形成配合物后与DNA 作用增强。抗肿瘤抗生素如丝裂霉素、博莱霉素、阿霉素的主要作用是通过与DNA 交联、嵌合或引起DNA 断链等作用方式干扰DNA 的合成。平阳霉素是博莱霉素的组分之一, 王自春等利用
14、紫外光谱观察了平阳霉素与小牛胸腺DNA 相互作用后的光谱变化。结果表明, 随着药物浓度的增大, 小牛胸腺DNA 的双螺旋逐渐解开, 碱基随之暴露, 当药物浓度足够大时, DNA 可能完全降解, 从而最大吸收峰位紫移。在对DNA 分子的研究中发现, 一些小分子不仅可作为生物探针, 还可成为以DNA 为靶目标的抗癌药物的母体。因此利用紫外光谱法对光谱小分子物质与DNA 分子的作用机制进行了大量的研究。周家宏、曹瑛、刘殿骏等均利用紫外光谱法研究了不同的条件下生物标记物吩嗪染料中性红( NR) 与小牛胸腺DNA 的作用机制, 获得了相似的结果。叶勇等利用紫外光谱法对席夫碱类配合物与DNA的作用进行了谱
15、学研究, 探讨了各类配合物与DNA 的作用机制, 对抗癌药物的进一步研究提供了理论依据。另外吴鸣虎等利用光谱法研究了二联吡啶并吩嗪混配物与核酸的相互作用, 实验证明混配物插入到DNA 的双螺旋结构中,可作为DNA 的探针。宋功武等利用紫外光谱法研究了甲基紫与核酸分子的相互作用机制。对探针小分子与核酸分子的作用机制研究, 有助于建立快速、简便测定核酸的新方法。2 红外光谱法在生物大分子研究中的应用211 红外光谱法在研究蛋白质结构方面的应用蛋白质二级结构( 如A2螺旋、B2折叠、B2转角等) 的酰胺带、带伸缩振动在红外光谱图谱上表现为特征性的吸收峰。从实验测得的红外光谱是真实光谱与仪器线性函数卷
16、积的结果, 卷积降低了光谱的分辨率而使谱带宽大。去除这个线性函数的影响称为解卷积或去卷积, 可以提高光谱的表观分辨率, 从而可将重叠的谱带分解成各个子谱带, 达到分峰的目的。运用傅里叶自解卷积将重叠的酰胺带分成数个单峰, 从而定量获取二级结构的含量信息, 因此傅里叶变换红外光谱(FT IR) 可以测定蛋白质在各种条件下二级结构的变化情况。对各峰的指认目前尚无统一的标准, 根据仪器、使用方法的不同, 所指认的结果略有不同, 较公认的对酰胺带中各子峰的指认是: 波数在1 650 1 658 cm- 1处峰面积代表A2螺旋的含量, 1 620 1 640 cm- 1处是B结构的含量。傅里叶自转积和二
17、阶导数光谱的应用, 大大提高了红外光谱的分辨率, 从而能有效地用于蛋白质热变性、溶剂变性、化学变性、化学修饰、配基结合和个别氨基酸残基替换所引起的微小构象变化的分析, 成为揭示蛋白质溶液构象变化的重要工具。和其他方法相比, 傅里叶红外光谱法不受分子量大小、光散射的影响, 较适用于研究生物状态下的蛋白质结构。Byler 等利用红外光谱对21 种球形蛋白进行了详细的分析, 并将它们的结果与通过X 射线衍射得到的结果作了比较, 两者符合得很好。Yomamoto 等应用差光谱和自转积技术研究了核糖核酸酶A 水溶液和重水溶液红外光谱对温度的依赖关系, 找出了蛋白质热变性过程中二级结构构象上的变化。Pur
18、cell 等应用FT IR 自转积和二阶导数光谱法研究了牛胰凝乳蛋白酶原A 在重水以及混合溶液中的构象变化, 结果溶剂变性出现两个新峰, 无序结构明显增加。傅晓红等利用FTIR 技术对胆碱脱氢酶( CDH) 处于非底物结合状态以及与底物作用过程中CDH 的二级结构的变化进行了研究。童义平等利用傅里叶红外光谱法研究了牛血清蛋白(BSA) 及其水溶液的红外光谱, 通过对其酰胺带进行傅里叶自转积谱分析, 为其及部分水溶液中的二级结构构象进行了指认。结果表明, BSA 水溶液状态与固态时的二级结构是不同的, 随着溶液浓度的降低, 酰胺带二级结构峰存在明显的位移现象, 说明溶液水对蛋白质结构链上的氢键产
19、生了影响, 从而造成了蛋白质二级结构构象的变化。周瑞明等利用红外光谱法研究鸡蛋白的二级结构中, 氢键的存在及它对维持蛋白质二级结构的空间构象所具有的作用。外来离子的加入会使二级结构的氢键受到一定程度的破坏, N ) H 和C O 相对反式排列构象减少, 而顺式构象增多, 从而从红外光谱分析推断, 蛋白质的二级结构是由于氢键的存在而维持起空间构象的稳定性。212 红外光谱法在研究核酸结构方面的应用当核酸分子与其配体形成了超分子体系时, 相互作用部位或基团伸缩振动受到影响, 从而红外光谱吸收峰频率发生一系列的位移, 根据位移可对超分子体系间选择性作用力作半定量研究。其他的研究方法还有核磁共振法、分
20、子散射法及X 射线单晶衍射法。20 世纪80 年代, 就已开展了抗癌药与核酸分子作用的研究。例如Theophanides 等研究了顺式二氨基二氯化铂作为抗癌药的药理作用。用牛胸腺DNA 和上述顺式铂盐的中性溶液混合, 其红外光谱吸收峰的诸多变化表明, 铂盐抗癌药通过改变水的构象攻击了DNA 结构起作用的鸟嘌呤中的N7 位置, 并改变了DNA 的二级结构。对化合物和DNA 相互作用体系的研究可揭示化合物的结构与生物活性的关系, 并对阐明药物在人体内的传输及药理作用具有重要的意义。参考文献 1 Chalasinski G, Szczesniak M M. Chem. Rev. , 1994, 94
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