1、 毕 业 论 文题 目：乙肝表面抗原的 ELISA 法定量分析方法学验证 姓 名： 学 号： 专 业： 指导教师： 教师职称： 研究起止日期： 研究提交日期： 二 一 三 年 十一 月目 录毕业论文 乙肝表面抗原的 ELISA 法定量分析方法学验证中文摘要.1英文摘要.1前言.21.材料与方法.31.1 试剂盒.31.2 仪器.31.3 方法.31.3.1 溶液配制.41.3.2 铺板方案.41.3.3 加样步骤.52. 结果.62.1 标准曲线与线性范.62.2 准确度（回收率）的验证.62.3 精密度的验证.72.3.1 板内精密度的验证.72.3.2 板间精密度的验证.82.4 检测限（
2、LOD）计算.103. 讨论.103.1 乙肝表面抗原定量分析的意义.103.2 常用定量分析方法.113.3 方法概述.113.4 方法学验证内容.123.5 结果分析及应用评价.13参考文献.14综述.15 致谢.18中文摘要0乙肝表面抗原的 ELISA 法定量分析方法学验证中文摘要目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的 HBsAg 的 ELISA 法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。方法：ELISA 法定量分析，应用试剂盒 HBsAg 标准品从浓度为 8ng/ml做 2 倍稀释的 6 个浓度梯度做标准曲线，以 6，3，1.5ng/ml 3 个浓度梯度 5 复孔做
3、准确度，精密度和检测限等方法学验证。结果：标准曲线 R2=0.997，准确度 97.07%，1.5ng/ml 的 RSD 为 16.78%，不满足 ng/ml 级水平的 RSD 一般应15%的要求，检测限 LOD 为0.172ng/ml，低浓度样品（1.5ng/ml）的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。结论：该 HBsAg 的 ELISA 法定量分析试剂盒不能用于临床标本的分析。关键词：乙肝表面抗原 ELISA 定量分析 方法学验证英文摘要1The reification of the HBsAg ELISA quantitativmethodologyAbst
4、ract In EnglishObject: to verify the quantitative methodology of Fuzhou blueprint biological engineering company to make sure whether it ca be used to the analysis of Clinical Sample. Methods: ELISA quantitative methodology , make an Application of the standard HBsAg kit from the concentration of 8
5、ng/ml do 2 times diluted six concentration gradient to constitute a standard curve, testing With 6, 3, 1.5 ng/ml 3 a concentration gradient 5 accurately precise and detection .Results: standard curve ,R2=0.997, the accuracy of RSD of 1.5ng/m is 16.78%，the RSD that cannot meet the demand of ng/ml bas
6、ic level is less than 15% in common. The LOD is 0.172ng/ml, the testing of Low concentration samples （1.5ng/ml）are lower than high concentration samples in both accuracy and precision , which as a result make it unsuitable for low concentration sample testing. Conclusion: the ELISA quantitative anal
7、ysis kit of HBsAg cannot be used for the analysis of Clinical Sample.Key words: HBsAg Quantitative analysis Verification Methodology.前言2乙肝表面抗原的 ELISA 法定量分析方法学验证前 言乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清标志物是检测乙肝病毒感染最主要的病原标志。随着免疫学技术的不断发展，抗原抗体检测灵敏度明显提高，使低水平乙肝病毒得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义1。ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半
8、定量测定等优点，可以在酶免疫分析仪上做批量检测。目前临床上多倾向于做定量分析，若想知道检验结果是否可靠，实验室则必须对所用试剂盒进行方法学验证，本实验对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行准确度，精密度和检测限等方法学验证，现报告如下。1. 材料与方法1.1 试剂盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。1.2 仪器酶标仪：Bio-Rad 680 ；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix ；电热恒温培养箱 (DNP-9052)上海精宏实验设备有限公司；振荡器（苏州管械，KJ-201A） ；移
9、液器；Tip头；EP 管。前言31.3 方法1.3.1溶液配置1PBS缓冲液的配置： 称取8g NaCl、 0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。标准品的配置：原始标准品浓度为8 ng/ml。 。取6个2mlEP管，分别标记为S1-S6。50ul/well, 共1孔需50ul，每孔配置 60ul备用，按照下表稀释方案进行稀释。表1 标准品的稀释方案质 控品的配 置：50ul/well, 共 5复孔需250ul ，配置300ul备用，取3个2mlEP管，分别标记为C1 ， C
10、2，C3，按照下表稀释方案进行稀释。表2 质控品的稀释方案1.3.2铺板方案 取编号 终浓度（ ng/ml）预加1PBS 标记 （ul ）剩余（ul）S1 8 0 标准品 120S2 4 60 S1 60 60S3 2 60 S2 60 60S4 1 60 S3 60 60S5 0.5 60 S4 60 60S6 0.25 60 S5 60 60取编号 终浓度（ ng/ml）预加1PBS 标记 （ul ）剩余（ul）C1 6 150 标准品 450C2 3 300 C1 300 300C3 1.5 300 C2 300 300前言4取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，按照下表铺板方案进行铺板在
11、相应孔中依次加入系列标准品、质控品及空白对照，每孔50ul。空白对照加入1PBS缓冲液。表3 铺板方案1.3.3加样步骤加入酶标抗体，50 ul/well，震荡。37电热恒温培养箱温育60min，取出后洗板4次， 加入A、B液, 50 ul/ well，37电热恒温培养箱温育15 min。加入终止液， 50 ul/ well。酶标板放入酶标仪，盖上盖子，在电脑上打开Microplate Manager 5.2软件，选择450nm波长（参照波长630nm） ，设置LAYOUT和报告模式，测定各孔吸收值。2. 结果2.1 标准曲线与线性范围标准品理论浓度对应的实测OD 值表4 实测OD 值1 2
12、3 4 5A S1 C1 C2 C3 PBSB S2 C1 C2 C3 PBSC S3 C1 C2 C3D S4 C1 C2 PBSE S5 C1 C3 PBSF S6 C2 C3 PBS前言5HBsAg(ng/ml) 8 4 2 1 0.5 0.25OD 1.66 1.00 0.62 0.39 0.31 0.27以HBsAg理论浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系，结果显示R2=0.9973，显示具有良好的相关性01234567890.0.51.01.52.0y = 0.186X + 0.2307 R2 0.973Conc(g/ml)Absorbance(OD)图
13、1 线性关系图2.2 准确度（回收率）的验证 质控品理论稀释浓度对应实测浓度值表 5 实测浓度值测定值HBsAg(ng/ml) 1 2 3 4 56 6.24 4.56 5.73 6.09 6.403 3.36 3.29 3.55 3.28 3.481.5 1.24 1.27 1.17 1.17 1.20质控品做了3个浓度梯度，每个浓度做了5个复孔，下表是对每个浓度梯度进行准确度（回收率）的验证。表6 准确度的验证HBsAg(ng/ml)测定值（ng/ml） 回收率（% ） 平均回收率RR（% ）3 个浓度的平均回收率前言66.24 103.934.56 75.925.73 95.576.09
14、 101.4566.40 106.6097.583.36 112.133.29 109.573.55 118.403.28 109.4033.48 115.83113.071.24 82.471.27 84.671.17 78.071.17 77.671.51.20 79.9380.5697.07%结果显示HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的平均回收率为97.58%，113.07%，满足限度要求在85%-115%的范围内，而HBsAg 1.5ng/ml的平均回收率为 80.56%，满足方法定量限在80%-120%的范围内。3个浓度梯度的平均回收率为97.7%，显示准确性好。2.3 精密度的验证2.3.1 板内精密度的验证表 7 板内精密度的验证测定值HBsAg(ng/ml)1 2 3 4 5 XSRSD(%)66.24 4.56 5.73 6.09 6.40 5.800.7412.7333.36 3.29 3.55 3.28 3.48 3.390.123.501.51.24 1.27 1.17 1.17 1.20 1.210.043.69上表中RSD(%)这一参数表示相对标准偏差，也就是变异系数
