1、柠檬酸钡法制备牦牛血中凝血酶工艺的研究前 言我国的牦牛约有 1300 多万头,占世界牦牛总数的 92%,主要分布于青海、西藏、四川、甘肃、新疆、云南等六省区 114 亿 km2的高寒草原区 1。我省牛的养殖量，特别是牦牛的养殖量相对较大，2006 年甘肃省牦牛存栏数约为 112 万头，占我国牦牛总头数的 7.8%，仅次于西藏、青海、四川，居全国第四位 2。牦牛屠宰后除了肉、皮毛被加工利用后，其副产物牦牛血液由于牲畜屠宰比较分散、以及技术水平低等原因利用率很低，除极少一部分经过简单的加工被利用外，大多被废弃 3。牦牛血中富含有各种营养成分，与其它家畜（黄牛、猪、羊）血液成分相比较，牦牛血液中蛋白
2、质含量最高占 18.5%。牦牛血液中有钠、钴、锰、铜、磷、铁、钙、锌等多种无机盐类，凝血酶含量较其它动物血液高出很多 4。所以综合开发利用牦牛血资源，从其中提取凝血酶可以大大提高牦牛产业的综合利用价值，具有极其重要的意义。凝血酶（Thormbin，EC3.4.21.5）是一种蛋白水解酶,在动物体内以凝血酶原形式存在,在一定条件下凝血酶原被激活为有活性的蛋白质水解酶，在血液凝固系统中起重要作用 5。它由 258 个氨基酸组成，分子量 33580，产品为白色无定型粉末，溶于水，不溶于有机溶剂，干粉贮存于 2-8很稳定，水溶液室温 8h 内失活，遇热、遇稀酸、碱、金属等活力降低 6。它能催化溶胶态的
3、纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。 此外凝血酶还有酯酶的活性, 可迅速分解 TAME(L精氨酸甲基酯) 7。凝血酶被乙酰化后，其蛋白水解酶活性丧失，但仍保持酯酶的活性。凝血酶的活性中心为丝氨酸；二异丙基氟磷酸不可逆地抑制凝血酶的蛋白水解活性和酯酶的活性 8。凝血酶可直接作用于血浆纤维蛋白原，加速不溶性纤维蛋白凝块的生成，促使血液凝固，具有较高的医学价值 9。目前凝血酶原的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法 3 种 10。本试验选取牦牛血为原料，利用柠檬酸钡吸附法经离心、透析、真空干燥，最终得到中凝血酶粗品，并通过试验
4、得到了最佳工艺路线及最优提取参数，为从牦牛血中凝血酶的提取提供了一定的理论依据，也为我省的牦牛副产物深加工开辟了一条新的出路。1 材料及方法1.1 材料1.1.1 原料 新鲜牦牛血1.1.2 试剂 柠檬酸三钠；氯化钠；丙酮；氯化钙；乙醚；凝血酶标准品；Tris （三羟甲基氨基甲烷，AR） ；EDTA ；盐酸。1.1.3 仪器设备 透析袋；低速冷冻离心机；恒温水浴锅；分析天平；真空干燥器；JJ-1 精密增力电动搅拌器；冰箱。12 方法1.2.1 提取工艺流程粗制凝血酶真空干燥凝血酶粗品乙醚洗涤4凝血酶原NaCl,CaCl2 丙酮35（15min）4（1h）凝血酶沉淀氯化钡，Tris-HCl血浆柠
5、檬酸钠抗凝、离心40000r/min（10min）牦牛血液1.2.2 操作要点1221 牦牛血浆制备 取屠宰场新鲜牦牛血，每千克牦牛血液加 3.8g 柠檬酸钠做为抗凝剂，搅拌均匀，降温至 4，以 4000 r/min 的速度离心 10min，收集上清夜，-20下冷藏备用 11。1.2.2.2 牦牛凝血酶原的制备 取100mL血浆，缓慢加入1.0mol/LBaCl 2溶液6mL，在磁力搅拌器上搅拌1h后，在4、4000r/min离心15min，柠檬酸钠和氯化钡发生化学反应，产生柠檬酸钡沉淀 12。收集柠檬酸钡沉淀，将沉淀溶于pH8.0，0.2mol/LEDTA溶液中，搅拌1h后，在4、4000r
6、/min离心10min，弃不溶物。将上清液装入透析袋中，在0.05mol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液中透析，不断更换透析液，至无Ba 2+为止，得到凝血酶原粗样品液 13。1.2.2.3 牦牛凝血酶原的激活将凝血酶原粗样品液在恒温35水浴锅中保温15分钟，然后加入等量的0.9%氯化钠溶液，搅拌均匀，加入浓度0.05mol/L氯化钙溶液，搅拌15min，4下放置1.5h，在4、4000r/min离心分离15min，取上清液，弃去沉淀，沉淀为纤维蛋白原 14。1.2.2.4 牦牛凝血酶粗品的制备将上清液加入 0.52.0 倍的冷冻丙酮，搅拌均匀，在 4下静置过夜。在4000r/min
7、下离心 15min 离心收集沉淀，溶液回收丙酮，沉淀用乙醚洗涤。然后，真空干燥，即得到凝血酶的粗品 15。1.3 单因素实验设计131 不同氯化钡处理下的单因素实验 在对凝血酶进行提取之前，取相同的样品 100mL 在氯化钙添加量为 1.5%，冷冻丙酮添加量为 1.0 倍条件下做不同氯化钡处理时间的单因素试验，即氯化钡添加量为 4mL，6mL，8mL，10mL，12mL，并对所得凝血酶进行活力测定，重复三次，选择最佳氯化钡添加量。132 不同氯化钙处理下的单因素实验 在对凝血酶进行提取之前，取相同的样品 100mL 在最佳氯化钡添加量的条件下，冷冻丙酮添加量为 1.0 倍条件下做不同氯化钙处理
8、时间的单因素试验，即氯化钙添加量为 1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，并对所得凝血酶进行活力测定，重复三次，选择最佳氯化钙添加量。133 不同冷冻丙酮处理下的单因素实验 在对凝血酶进行提取之前，取相同的样品 100mL 在最佳氯化钡和最佳氯化钙添加量的条件下做不同丙酮加入量的单因素试验，即冷冻丙酮添加量为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 倍，并对所得凝血酶进行活力测定，重复三次，选择最佳冷冻丙酮添加量。1.4 正交试验设计加入氯化钡溶液的量、加入氯化钙的量以及冷冻丙酮的加入量为本试验中较为关键的因素，在设计中采用正交设计法设计试验（表 1）并且通过试验从中筛选出较为理想的
9、提取工艺。表 1 L9(34)正交试验设计试验因素水平表水平因素氯化钡加入量（mL） 氯化钙加入量 冷冻丙酮加入量1 5 1.0% 0.52 8 1.5% 1.03 10 2.0% 1.51.41具体方法为：取 0.2ml 用生理盐水稀释 1 倍的牦牛血浆作为底物，在 37保温 2min 后，加入 0.1ml 稀释的凝血酶液。记录血浆的初凝时间，与凝血酶标准品作对照来确定凝血酶的活力 18。在测定过程中控制血浆的初凝时间在14100s 之间。1.5 检测1.5.1 标准曲线的绘制 按中华人民共和国药典，取凝血酶标准品，用 0.9%氯化钠溶液分别制成每毫升含 5.0U、6.4U、8.0U、10.
10、0U 的标准品溶液。另取内径 1cm，长 10cm 的试管 4 支，各精密加入稀释一倍的牦牛血浆 9mL。37保温 2min 分别加入上述4 种标准品溶液各 1mL，立即计时，摇匀，置 37恒温水浴锅中，观察稀释牦牛血浆的初凝时间，每种浓度测 4 次，求平均值（4 次测定之最大值与最小值的差不得超过平均值的 10%） 。标准品的浓度应控制初凝时间在 14100s 为宜。2 结果与分析2.1 标准曲线的绘制酶单位（u）与初凝时间（s）关系见下表酶单位（u）与初凝时间（s）关系表浓度(U/mL) 组号10 8 6.4 51 36 60 75 922 30 75 80 853 35 48 65 74
11、4 31 50 56 76平均值 33 49.5 69 81.75在坐标纸上以每管标准品实际单位数为横坐标，凝结时间为纵坐标，绘制标准曲线（见图 1） ，得回归方程 y = -9.9522x + 131.46，相关系数R2=0.9941，趋近于 1，可见标准曲线的回归方程可以用于计算。图 1 凝 血 酶 标 准 曲 线y = -9.9522x + 131.46R2 = 0.994120304050607080904 5 6 7 8 9 10 11酶 活 力 (U/mL)时间(s)参考文献1 陈文建.凝血酶精制的新方法.江西医药.2003,06：50522 蔡玉婷.应用生物技术分离纯化类凝血酶.
12、福建水产.2002,04：78813 晓明.凝血酶研制通过专家鉴定.食品与生活.1997,02：594 施大林,陆茂林,吕惠敏,等.猪血凝血酶的制备.生物技术.2002,01：97995 欧伶,宋聿文,刘永, 等.猪凝血酶原的制备.中国医药工业杂志.1997,10：45496 陆茂林,施大林,吕惠敏,等.凝血酶制备工艺的研究J.中国生化药物杂志.2002,23 (3):152153.7 史永昶,马中良,姜涌明,等.猪凝血酶的亲和层析纯化及其酶原的激活J.江苏农学院学报.1997,18(4):9799.8 宋宏新,马永征,李敏康. 凝血酶分离纯化方法的研究进展J.食品研究与开发. 2004,25(6):6567. 9 李敏康,周文静.猪血凝血酶的分离与纯化J.陕西科技大学学报. 2003, 21(4):4042.
