1、实验三 叶绿体色素的提取、分离、性质及含量,一、实验目的,掌握叶绿体色素的提取方法； 掌握纸层析法分离叶绿体色素的原理和步骤； 掌握叶绿体色素的部分理化性质。,二、实验原理,2.类胡萝卜素,（一）叶绿体色素：,胡萝卜素叶黄素,（二）四种色素的化学性质,均为亲脂性亲水性：均不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。 极性大小：叶绿素b叶绿素a叶黄素胡萝卜素根据相似相溶原理，在有机溶液中的溶解度：叶绿素b叶绿素a 叶黄素胡萝卜素,叶绿素的卟啉环：,叶绿素分子头部的金属卟啉环中心均为Mg2+。 在弱酸作用下，叶绿素分子中的镁可被H + 取代而形成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则可形成绿色
2、的铜代叶绿素。 铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制做植物的原色标本。,（三）叶绿素的光学性质,叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。,叶绿素的荧光现象,叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而反射光下呈红色的现象。,三、实验材料与试剂,新鲜的菠菜叶片。 95%乙醇 、CaCO3、醋酸铜结晶、浓盐酸、汽油。 量筒，滤纸，大培养皿一只，小培养皿一只，长滴管，剪刀。,四、实验步骤,1、 叶绿体色素提取：将菠菜叶片擦净，去中脉后取 10g剪碎，加少许碳酸钙和石英砂，再分次加入10mL酒精研磨，过滤，定容至50ml，分装于5个试管内，容量分别为10ml。,2
3、,3,4,5,1,2、叶绿体色素的分离（纸层析法）,用滤纸条浸色素提取液（试管1），吹干，反复多次；将带色素的滤纸条卷成灯芯，将表面皿放在培养皿内，注上汽油，把灯芯浸在汽油内，加盖，色素层分清后，取下吹干，即可看到分离的各种色素。,标明各层成分名称和判断依据。,3、叶绿体色素吸收光谱曲线,取1ml提取液于比色杯中（试管2），加3ml95%乙醇。 用95%乙醇作为对照，在400700nm之间每隔20nm测一次光。 记录波长和吸光度A于下表中，并在标准绘图纸上绘出叶绿体色素的吸收光谱曲线。,4、叶绿体色素含量的计算,在标准曲线上查出波长600nm时的叶绿体色素浓度。 叶绿体色素含量（mgg-1）=
4、,5、叶绿素提取液荧光现象观察,取试管3： 从与入射光垂直的方向观察； 再在透射光方向观察叶绿体色素溶液的颜色； 记录叶绿素体色素溶液颜色有何不同 ，分析原因。,6、光对叶绿素的破坏作用,将试管4置于暗处，试管3置于强光下，照射23小时后，观察试管颜色的变化，解释这种现象。,7、铜代叶绿素反应,向试管5中逐滴加入浓盐酸，并不断摇匀，至颜色变化，观察并记录现象； 向变色后的叶绿素溶液中加入少量醋酸铜，并在酒精灯上缓缓加热，观察并记录颜色的变化。 分析原因。,五、注意事项,分离色素用的圆形滤纸，在中心打的小圆孔，周围必须整齐，否则分离的色素不是一个同心圆。 每次改变波长后，要用95%乙醇重新调零。,六、实验结果,画图说明叶绿体色素纸层析结果，并解释原因。 在标准绘图纸上绘出叶绿体色素的吸收光谱曲线并计算色素含量。 解释叶绿素的荧光现象。 解释光对叶绿素的破坏作用现象。 解释叶绿体色素分子的替代作用现象。,七、思考题：,1、用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水丙酮等提取干燥材料中的叶绿体色素，结果会如何？为什么？、研磨提取叶绿素时，为何要加入CaCO3？3、铜在叶绿素分子中具有替代镁的作用，这有何实用意义？,
