1、 有机酸工艺学作业学院：生物工程学院专业：生物化工学号：10043120姓名：冀 蓉在有着降低的磷酸果糖激酶的柠檬酸控制的黑曲霉突变体中锰离子对柠檬酸积累的抑制作用有着降低的碳水化合物代谢的柠檬酸控制的黑曲霉突变菌株（cic 突变株）在含有 5 %（重量/体积）柠檬酸盐的基质中比亲本更快生长。该突变体耐受一个比亲本更高的细胞内柠檬酸浓度。突变体（cic-713）含有的磷酸果糖激酶活性明显对柠檬酸不太敏感比亲本中的酶。当这种突变体在柠檬酸积累条件下生长时，产酸对 Mn2+ 的抑制作用远没亲本那么敏感。cic 突变株中的一些也表现出改变的 NADP-异柠檬酸脱氢酶的柠檬酸抑制作用。经由丝状真菌黑曲
2、霉的大量柠檬酸的积累众所周知取决于各种环境因素，其中营养培养基中的 Mn2+ 水平起着关键的作用。 只有当 Mn2+ 浓度低于 0.02 mM （不影响生长速率和产量）时，柠檬酸积累大量（17） 。一个关于锰的影响的生化解释最近已经被提出。Mn 2+ 不足导致蛋白质流通量的增加，这最终导致一个高的 NH4+ 细胞内浓度（7，9） ；这个水平的 NH4+ 能抵消经由柠檬酸（4，5）的磷酸果糖激酶的抑制作用，从而保证一个高的葡萄糖分解率通过果糖二磷酸途径，这对于柠檬酸积累（17）是必要的。根据这个模型，Mn 2+ 不足对于用柠檬酸消除糖酵解的反馈抑制基本上是必须的。如果这个模型是正确的，那么缺乏磷
3、酸果糖激酶的柠檬酸抑制作用的突变株甚至 Mn2+ 存在应该也能积累柠檬酸。为了检验这个假说，黑曲霉 B 60（7）被繁殖在马铃薯葡萄糖琼脂中 7 天，并且收获分生孢子，稀释在含有 0.1 %（重量/体积）吐温 80 的无菌水中到一个最终浓度 2106 个分生孢子每毫升，并且大力摇晃破坏团块。10 ml 该悬液然后被放置在一个开放的培养皿中在紫外线杀菌灯下面 14 cm 并且磁力搅拌 5 min。随后，悬液被用铝箔遮盖 1 h 并且用于潜在突变体的筛选。它们的鉴定是基于假设缺乏磷酸果糖激酶的柠檬酸控制的突变体在含柠檬酸的蔗糖培养基上生长更快，例如下面所讨论的。由于这个原因，经稀释，诱变的分生孢子
4、悬浮液被镀在含有 20 %（重量 /体积）蔗糖和 5 %（重量 /体积）柠檬酸作为碳源的固体培养基上。其他无机营养物和氮源基本上被用在柠檬酸生产培养基中（8） ，除了用 H2SO4 将 pH 调整到 3.5。牛胆汁（0.5 %重量/体积）被添加到培养基限制增长小，定义的菌落（15） 。增长最快的菌落被认为较小影响碳水化合物的分解通过柠檬酸并且因此被选中作进一步的分析。通过这种方法，几千个黑曲霉 B 60 菌落的筛选允许检测出 20 到 30 个潜在的突变体，这些突变体与亲本相比在蔗糖和柠檬酸面前呈现出一个明显减少的增长滞后时间。为了淘汰吸收缺陷突变体，所有的菌落被检查在仅含柠檬酸或葡萄糖作为碳
5、源的培养基上的生长。没有一个突变体呈现出形态学改变。十二个突变体在几次转种后稳定并且被用于做进一步调查。亲本菌株和假定的突变体，它们被期望通过柠檬酸不敏感的碳水化合物的分解代谢（cic）特征化，在柠檬酸非累积型培养基中生长 40 h。收获菌丝并且用先前所述的超声波降解法使其均质在 50 mM 含 1 mM EDTA，5 mM 2-巯基乙醇和 20 %（重量/体积）甘油的咪唑缓冲液（pH 7.8）中。从细胞抽提物中纯化磷酸果糖激酶（EC 2.7.1.11）并测定如所描述的其他一样。当所有的 12 个稳定突变体的磷酸果糖激酶被研究关于柠檬酸的抑制作用时，没有完整的柠檬酸不敏感酶可以在任何 cic
6、突变体中被发现。有完全柠檬酸不敏感磷酸果糖激酶的突变体不能被分离是可能的。然而在两个菌株即 cic-713 和 cic-1 中，酶比亲本菌株的酶对生理浓度的柠檬酸盐（1 到 3 mM；图 1 ）较不敏感。当柠檬酸影响的研究与培养基 6-磷酸果糖浓度（图 2）有关时，突变体 cic-713 在柠檬酸存在时表现出的动力学出现复杂；直到浓度为 1.5 mM 6-磷酸果糖，柠檬酸几乎没有影响，并且它只有在 6-磷酸果糖浓度高于 2 mM 抑制。由于黑曲霉中细胞内 6-磷酸果糖的浓度低于 1.5 mM ，该突变体表现出含有磷酸果糖激酶，这种酶在生理培养基条件下对柠檬酸不敏感。黑曲霉中葡萄糖分解代谢的柠檬
7、酸抑制作用只有在磷酸果糖激酶水平不发挥作用。图 1 B 60 亲本（ ）和它的 cic 突变体（，cic-7/3；，cic-6/3；，cic-1；，cic-7/1）的磷酸果糖激酶的柠檬酸抑制作用。酶用如前所述的亲和层析法纯化。光学试验要求的辅助酶在用于去除硫酸铵前透析，否则会干扰酶的柠檬酸抑制作用的研究。活力是给定的没有柠檬酸时的活力的百分比。各种突变体的磷酸果糖激酶的 Vmax 值列举如下（U/mg 蛋白质标准偏差）：B60，0.250.02；cic-7/3，0.270.02；cic-6/3，0.200.015；cic-柠檬酸（mM）活力（%）1，0.300.02；cic-7/1，0.250
8、.02。图 2 黑曲霉 B 60 亲本（ ，）和 cic-7/3 突变体（，）在测试系统中缺少（，）和有（，）2.5 mM 柠檬酸时的磷酸果糖激酶（F-6-P）的底物动力学。所有的条件，包括二者酶制剂的 Vmax ，都在图例 1 中被标示。最近 Mischak 等人发现，黑曲霉的葡萄糖转运系统被柠檬酸抑制。我们已经进一步分析了关于这种抑制作用的 cic 突变体。两个突变体（cic-6/3 和cic-7/1）实际表现出葡萄糖转运系统对柠檬酸不敏感，然而 cic-7/3 的转运系统表现出没有被改变（表 1） 。表 1 黑曲霉 B 60 和 cic 突变体中葡萄糖转运的抑制作用葡萄糖转运 a 的 V
9、max 菌种没有柠檬酸 0.25 M 柠檬酸B 60cic-7/3cic-1cic-6/3cic-7/10.8400.0570.8000.0600.4800.0350.7600.0600.8600.0420.4000.0400.3600.0500.1450.0451.0200.0450.7900.037a毫摩尔葡萄糖吸收每克菌丝体（干重）每小时，如吸收试验所推断的。价值是标准偏差。cic 突变体接下来被研究关于 Mn2+ 离子对柠檬酸积累的抑制作用。柠檬酸发酵培养基中黑曲霉的培养如前面描述的进行。蔗糖（14%，重量/体积）在用Dowex AG50 W-X8 去除锰和来自它的其他金属离子杂质后被
10、用作碳源。所有的cic 突变体在缺乏 Mn2+ 离子时大量生产柠檬酸（ 60 克/升） ，尽管一些突变体不能实现亲本的浓度测定（表 2） 。然而在有 20 uM Mn2+ 离子存在时，柠檬酸的产量急剧下降，如先前所报道的。突变体 cic-7/3 然而积累缺乏条件下的产量的 50%，即，Mn 2+ 含有条件下亲本 B 60 产量的二倍（表 2） 。在这些试验中，培养液中的柠檬酸通过用 0.1 N KOH 对酚酞定量滴定，并且这个过程的有效性惯常用高压液相色谱法来检查，如别处描述的。由于缺乏 Mn2+ 时的柠檬酸生产被认为是细胞内 NH4+ 的积累，NH 4+ 拮抗磷酸果糖激酶的柠檬酸抑制作用，值
11、得注意的是没有一个突变体在 20 uM Mn2+ 存在当提取和检测时表现出升高的 NH4+ 细胞内浓度，如参考文献 4 和 5 所描述的。同时，没有一个突变体出现丧失吸收 Mn2+ 的能力，因为所有的 cic 突变体在含有 Mn2+ 的培养基中表现出典型的丝状形态，依赖 Mn2+ 的吸收。表 2 黑曲霉 B60 和 cic 突变体中锰离子和细胞内 NH4+池对柠檬酸积累的抑制作用菌种柠檬酸积累（克/升）细胞内NH 4+ 池的浓度没有 Mn 2+ 20 uM Mn2+ B 60cic-7/3cic-1cic-6/3cic-7/18577365791021211414123395843342862
12、.30.61.90.72.00.62.60.51.50.6a 培养液中的柠檬酸在柠檬酸生产条件下被测定在 150 h 存在 20 uM Mn2+ 之后和培养240 h 缺乏 Mn2+ 之后。价值是收入至少三次单独运行的标准偏差。b细胞内 NH4+池的浓度由来自在 20 uM Mn2+ 存在下生长在柠檬酸生产培养基 70 h 的磷酸果糖激酶（F-6-P）的培养动力学决定。细胞内的浓度被表示为细胞溶质（平均分布）中的毫摩尔并且从菌丝干重测定中计算出来通过假设细胞内体积 2.43 ml 每克干重。 价值是收入至少三次单独测定的标准偏差。以上结果表明在含 Mn2+ 离子的培养基上黑曲霉柠檬酸产量的增加
13、随着磷酸果糖激酶柠檬酸控制的减少，这与我们先前对于柠檬酸积累 Mn2+作用模型的假设是一致的。然而，柠檬酸获得的最终产量仍然只有锰缺乏下获得的 50%。这种锰作用的完全拮抗作用的缺乏可以用 对柠檬酸不完全不敏感的磷酸果糖激酶解释，这可能导致发酵后期的抑制作用，当细胞内柠檬酸的浓度非常高时（9 uM） 。另一方面应当指出的是，一些生理活动总伴随着锰的缺乏（即，脂质合成中的变化，膜和细胞壁，和呼吸活动 ） ，它们在柠檬酸积累中的作用仍不清楚，但是对获得高产量可能是必要的。柠檬酸积累规律的另一重要点已被假定发生在 NADP-特异柠檬酸脱氢酶。这种酶的柠檬酸抑制作用被称为柠檬酸积累的关键事件。因此，c
14、ic 突变体中的这种酶的柠檬酸抑制作用的动力学已被研究（表 3） 。两个突变体（cic6/3和 cic7/1）的酶对柠檬酸有一个减少的 Ki ，这可被解释为表明其柠檬酸抑制作用比亲本 B 60 中的更强。突变体 cic-7/3 中的酶的动力学性质与亲本的相比并不明显不同，除了 Vmax ，这是显著增加的。这种差异可表明该菌株中的酶是高产的。不同菌株在 Mn2+ 缺乏时生产柠檬酸的能力和它们的 NADP-特异柠檬酸脱氢酶对柠檬酸的敏感性间的相关性观察不到。这个观察和我们的假设，这种酶的柠檬酸抑制作用在该真菌产酸中没有主要作用。近来，我们能用黑曲霉中纯化的 NADP-异柠檬酸脱氢酶的动力学研究来支
15、持这一假设，这个研究表明柠檬酸只有在生理不正常低浓度 Mg2+ 下抑制这种酶。目前的结果因此支持这个假设，磷酸果糖激酶的柠檬酸抑制作用的减轻是与黑曲霉产酸锰缺乏刺激的一个重大事件。 表 3 黑曲霉 B 60 中 NADP-特异柠檬酸脱氢酶的动力学 a硫酸铵分馏（46 到 70 饱和度）的细胞提取物，通过穿过一个小的 Sephadex G 25 圆柱（1580 mm）脱盐，被用于动力学研究。双对数图和 Dixon 图被用于 Vmax ，K m，Ki 的测定。用先前描述的方法测定活力，Mn 2+作为辅助因子（0.5 mM 最终浓度） 。价值是收入NADP-特异柠檬酸脱氢酶 b的动力学值菌种 Vma
16、x（U.mg -1） K m IC（mM） K iCit（mM）0.1030.009 0.050.02 2.90.60.1910.015 0.080.03 3.61.0 0.1210.011 0.050.01 0.90.50.1340.016 0.060.02 5.70.9 B 60cic-7/3cic-1cic-6/3cic-7/1 0.1940.020 0.040.02 1.00.3 至少三次单独测定的标准偏差。具体的活力表示为底物微摩尔量被转化每分钟每毫克蛋白质，用 Bradford 法测定。bIC，异柠檬酸脱氢酶；Cit，柠檬酸。参考文献（引用文献）1. Bradford, M. M.
17、 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Anal. Biochem. 72:248-254.2. Clark, D. S., K. Ito, and H. Horitsu. 1966. Effect of manganese and other heavy metals on submerged citric acid fermentation of mol
18、asses. Biotechnol. Bioeng. 8:465-471.3. Dagley, S. 1970. Citric acid. UV-spectrophotometric determination, p. 1607-1611. In H. U. Bergmeyer (ed.), Methods in Enzymatic analysis. Verlag Chemie, Weinheim, Federal Republicof Germany.4. Habison, A., C. P. Kubicek, and M. Rohr. 1979. Phosphofructokinase
19、as a regulatory enzyme in citric acid producing Aspergillus niger. FEMS Microbiol. Lett. 5:39-42.5. Habison, A., C. P. Kubicek, and M. Rohr. 1983. Partial purification and regulatory properties of phosphofructokinase from Aspergillus niger. Biochem. J. 209:669-676.6. Kisser, M., C. P. Kubicek, and M
20、. Rohr. 1980. Influence of manganese on morphology and cell wall composition of Aspergillus niger during citric acid fermentation. Arch. Microbiol.128:26-33.7. Kubicek, C. P., W. Hampel, and M. Rohr. 1979. Manganese deficiency leads to elevated amino acid pools in citric acid producing Aspergillus n
21、iger. Arch. Microbiol. 123:73-79.8. Kubicek, C. P., and M. Rohr. 1977. Influence of manganese on enzyme synthesis and citric acid accumulation in Aspergillus niger. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 4:167-173.9. Ma, H., C. P. Kubicek, and M. Rohr. 1985. Metabolic effects of manganese deficiency i
22、n Aspergillus niger: evidence for increased protein degradation. Arch. Microbiol. 141:266-268.10. Maitra, P. K., and R. W. Estabrook. 1964. A fluorometric method for the enzymatic determination of glycolytic intermediates.Anal. Biochem. 7:472-484.11. Mattey, M. 1977. Citrate regulation of citric aci
23、d production in Aspergillus niger. FEMS Microbiol. Lett. 2:71-74.12. Meixner, O., H. Mischak, C. P. Kubicek, and M. Rohr. 1985. Effect of manganese deficiency on plasma membrane lipid composition and glucose uptake in Aspergillus niger. FEMSMicrobiol. Lett. 26:271-274.13. Meixner-Monori, B., C. P. K
24、ubicek, A. Habison, K. M. Kubicek-Pranz, and M. Rohr. 1985. Presence and regulation of the a-ketoglutarate dehydrogenase multienzyme complex in the filamentous fungus Aspergillus niger. J. Bacteriol. 161:265-271.14. Mischak, H., C. P. Kubicek, and M. Rohr. 1984. Citrate inhibition of glucose uptake
25、in Aspergillus niger. Biotechnol. Lett.6:425-430.15. Montenecourt, B. S., and D. E. Eveleigh. 1977. Semiquantitative plate assay for determination of cellulase production by Trichoderma viride. Appl. Environ. Microbiol. 33:178-183.16. Orthofer, R., C. P. Kubicek, and M. Rohr. 1979. Lipid levels and
26、manganese deficiency in citric acid producing strains of Aspergillus niger. FEMS Microbiol. Lett. 5:403-406.17. Rohr, M., C. P. Kubicek, and J. Kominek. 1983. Citric acid, p.456-478. In H. J. Rehm and G. Reed (ed.), Biotechnology, vol.3. Verlag Chemie, Weinheim, Federal Republic of Germany.18. Rohr,
27、 M., P. J. Stadler, W. 0. J. Salzbrunn, and C. P. Kubicek.1979. An improved method for assessing citric acid production.by conidia of Aspergillus niger. Biotechnol. Lett. 1:281-286.19. Rohr, M., 0. Zehentgruber, and C. P. Kubicek. 1981. Kinetics of biomass formation and citric acid production by Asp
28、ergillus niger on a pilot plant scale. Biotechnol. Bioeng. 23:2433-2445.20. Slayman, C. W., and E. L. Tatum. 1964. Potassium transport in Neurospora. I. Intracellular sodium and potassium concentrations,and cation requirements for growth. Biochim. Biophys.Acta 88:578-592.21. Uhr, M. L., V. W. Thomps
29、on, and W. W. Cleland. 1974. The kinetics of pig heart triphosphopyridine nucleotide isocitrate dehydrogenase. I. Initial velocity, substrate and product inhibition and isotope exchange studies. J. Biol. Chem. 249:2920-2927.22. Zehentgruber, O., C. P. Kubicek, and M. Rohr. 1980. Alternative respiration in Aspergillus niger. FEMS Microbiol. Lett.8:71-74.
