1、,通过研究“基因敲除”的耗子将帮助研究人类的癌症、糖尿病和高血压等慢性疾病与遗传的关系。,转基因羊 具有生长快、毛质、肉质好、疾病少及耐粗饲料等优点。,在猴子的未受精卵中加入附加基因，并利用它成功培育出健康活泼的小猴“安迪”。 通过对“安迪”的研究我们可以简单地引进如老年性痴呆病的基因、帕金森病基因等，加快针对这类疾病疫苗的开发研究。,甲生物,乙生物,新类型,基因敲除技术,转基因技术,生物,新类型,definition,The formation of new combinations of heritable material by the insertion of nucleic acid
2、 molecules，produced by whatever means outside the cell， into any virus, bacterial plasmid or other vector system so as to allow their incorporation into a host organism in which they do not naturally occur but in which they are capable of continued propagation.,基因工程,5,2,3,4,1,6,7,8,9,基因工程的基本概念,基因工程的
3、基本原理,基因工程所需的基本条件,基因工程的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,大肠杆菌基因工程,酵母基因工程,哺乳动物基因工程,高等植物基因工程,D 基因工程的基本形式,1 基因工程的基本概念,C 重组DNA技术与基因工程的基本用途,B 基因工程的基本定义,A 重组DNA技术的基本定义,A 重组DNA技术的基本定义,1 基因工程的基本概念,重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。,基
4、因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。,制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。,1. 对环境的影响,2. 新型病毒的出现,重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。,一、基因工程的安全隐患,基因工程的安全性,将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。,4. 人造生物扩散,新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。,3. 癌症扩散,1. 公众的担忧,二、重组DNA研究的安全准则,1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出
5、具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。,1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请Paul Berg博士组成一个重组DNA咨询委员会。,这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信（science,158,303)，要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。,2. 专家的态度,3.制定安全规则,1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。,规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。
6、1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。,分4级：P1P4级。,（1）实验室的物理安全,4. 基因工程的安全措施,一般装备良好的普通微生物实验室。, P1级实验室, P2 级实验室,在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。,全负压的实验室，同时装备安全操作柜。, P4级实验室,专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。 具有最高安全防护措施。, P3 级实验室,在自然环境中无法存活。,（2）实验室的生物安全,分3 级（大肠杆菌）：EK1EK3级。, EK1级的大肠杆菌,在自然环境中一般都要死亡。, EK2-EK3级大肠杆菌,第一个“安全”菌株是K12（
7、1976年），很不实用，已淘汰。,（3） 载体的安全,应该是失去了自我迁移的能力。,不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。 （容易构建）。如pMB9，pBR322等。,B 基因工程的基本定义,1 基因工程的基本概念,基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。,gene manipulation, gene cloning, recombinant DNA technology, genetic modi
8、fication, new genetics, molecular agriculture,重组DNA技术相关概念,克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一） DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）,DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子
9、细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。,(二)目的基因,需要克隆的DNA片段。,编码某种蛋白质,研究某基因结构和功能的关系,研究某基因与疾病的关系,按照人的愿望设计和建造非天然的基因表达体系。,基因工程产品,cDNA：经反转录合成的、与mRNA互补的DNA链。基因组DNA：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。,基因工程 细胞工程发酵工程 酶工程,生物工程,1、概念：也叫生物技术，是生物科学与工程技术有机结合而兴起的一门综合性科学技术。,2、特点：以生物科学为基础，运用先进的科学原理和工程技术手段来加工或改造生物
10、材料，如DNA、蛋白质、染色体、细胞等，从而生产出人类所需要的生物或生物制品。,3、内容：,地位：,现代科技革命,高新技术,生物技术,基因工程,基因克隆,概念：一般指利用分子生物学的手段 ，在体外操纵、改造、重建细胞的基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，获得人们所需的性状。 特点：基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传性，并通过工程化手段为人类提供有用的产品及服务。,基因工程,由于基因工程是在分子水平上进行操作，最终是为了创造出人们所需要的新品种，因而它可以突破物种间的遗传障碍，大跨度的超越物种间的不亲和性。 比如在基因工程中最常使用的大肠杆菌，它是一种原核生物，但它却能
11、大量表达来自于人类的某些基因。例如各种人的多肽生长因子基因就可用大肠杆菌来生产。 如果用常规的育种技术来做同一项工作，那么成功的机会应为零。因此，科学家们可以利用基因工程实现人类的各种物种改良的愿望。,因为现在生活在地球上的各种生物都是经过长期的生物进化演变而来，虽然不能说它们都很能适应现在的生态环境，但至少可以说它们基本上都能适应当前的生态环境。 这也就是说，每种生物体内或细胞内都处于精巧的调节控制和平衡之中。当用基因工程方法引入一段外源基因片段后，原有的平衡可能被打破，有可能导致细胞内的生物学功能发生紊乱，最后有可能导致细胞生长缓慢乃至细胞死亡。 很显然，开展基因工程研究的目的既要使细胞象
12、往常一样正常生长，又要使细胞产生甚至大量产生人类所需要的外源基因表达产物。,？,2.基因、DNA、染色体 之间是怎样的关系？,核糖体,基因的结构,（原核细胞）,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,能够转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质,不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质,非编码区：,编码区,真核细胞的基因结构,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能
13、转录为信使RNA,内含子:,外显子:,人的血红蛋白中，有一种蛋白质叫做珠蛋白，它的基因有1700个碱基对，其中有3个外显子和2个内含子，能够编码146个氨基酸，其外显子的碱基对在整个基因碱基对中所占的比例是多少,人的一种凝血因子的基因，在它的186000个碱基对中，有26个外显子和25个内含子，能够编码2552个氨基酸，其外显子的碱基对在整个基因碱基对中所占的比例是多少,14631700100%=26%,25523186000100%=4%,原核生物基因表达的调控,乳糖代谢基因表达调控图解：(没有乳糖时),lacZ,lacY,lacA,调节基因,启动子,操纵基因,结构基因,RNA聚合酶,信使R
14、NA,转录,翻译,阻抑物与 操纵基因 结合，结 构基因转 录受阻,阻抑物,原核生物基因表达的调控,乳糖代谢基因表达调控图解：(有乳糖时),lacZ,lacY,lacA,调节基因,启动子,操纵基因,结构基因,RNA聚合酶,信使RNA,转录,翻译,阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变，因而不能与操纵基因结合，使得结构基因进行转录。,阻抑物,乳糖,转录,半乳糖苷酶,酶,酶,C 重组DNA技术与基因工程的基本用途,1 基因工程的基本概念,分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源,大规模生产生物活性物质,设计、构建生物的新性状甚至新物种,大规模生产生物活性物质,工程细胞,基因工程 蛋白质工程 途径工程,发酵
15、工程 细胞工程,分离工程,酶,酶工程,分 离 工 程,野生细胞,野生细胞,生物活性物质,、基因工程与医药卫生,我国生产的部分基因 工程疫苗和药物, 基因工程药品的生产,许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。,微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。,1976年，27岁的风险投资人Robert Swanson与University of California的教授Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束
16、时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（Genetic Engineering Technology）。,第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！,Genentech的骄人业绩,胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!,干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍
17、贵”程度自不用多说。,重组DNA医药产品,美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）,中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）, 基因诊断与基因治疗,运用基因工程设计制造的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。,基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,基因诊断,基本过程,区分或鉴定DNA的异常,分离、扩增待测的DNA片断,标准 . 能正确扩增靶基因； . 能准确区分单个碱基的差别； . 本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定; . 便于完全自动化操作，
18、适合大面积、大人群普查。,基因诊断的技术和方法 1.核酸分子杂交实质上是用已知序列的DNA或RNA片段作为探针与待测样品的DNA或RNA序列进行核酸分子杂交。是基因诊断最基本的技术之一。 2.PCR法 3.分子探针：分子探针是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。满足：（1）必须是单链核酸，（2）带有容易被检测出来的标记物。,生物芯片,从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高
19、效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。,基因治疗,定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy),1. 产前诊断 2. 携带者测试 3. 症候前诊断 4. 遗传病易感性,遗传疾病的预防,医药,药物基因组学,人工设计,克隆P450s,疾病的动物模型,治疗性小分子,植物,微生物,诊断用蛋白,治疗性蛋白,微生物,动物,疫苗,植物,微生物,治疗性核酸,
20、基因治疗,基因修复,反义药物,DNA疫苗,诊断性核酸,遗传病,传染病,1. 提高植物的光合作用效率,改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。,（1）提高CO2的固定率,改变光能交换系统的分子的基因结构。,（2）提高光能吸收率和转化率,、基因工程与农牧业、食品工业,使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。,2. 提高豆科植物的固氮效率,是农业生物技术的主要内容。 是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。,3. 转基因植物,世界各国转基因作物大田释放情况（1987.1-1998.4）,中国已经批准进入大田的转基因植物（1
21、998.3）,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯,不会引起过敏的转基因大豆,将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。 使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。,4. 转基因动物,在乳汁中分泌人组织纤溶酶源激活物（TPA）和尿激酶的转基因小鼠； 分泌a1抗胰蛋白酶的转基因山羊等。,生长快、肉质好的转基因鱼(中国),乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠,导入人基因具特殊用途的猪和小鼠,超级动物,特殊动物,3、基因工程与环境保护, 环境监测： 基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。,1t水中只
22、有10个病毒也能被DNA探针检测出来,利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。, 环境污染治理： 基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。,4、基因工程在工业中的应用,克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。,用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。,1. 纤维素的
23、开发利用,2. 酿酒工业,D 基因工程的基本形式,1 基因工程的基本概念,第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程,第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程,第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程,第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程,蛋白质工程与基因工程的区别,蛋白质工程就是根据蛋白质的精细结构与功能之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。蛋白质工程自诞生之日起，就与基因工程密不可分。 基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，
24、它的产品还是该基因编码的天然存在的蛋白质。 蛋白质工程则更进一步。它可以根据对分子预先设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对它所编码的蛋白质进行改造。因此，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的、具有了人类所需要的优点的蛋白质。天然蛋白质都是通过漫长的进化过程而形成的，而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，好比是在实验室里加快了进化的过程。,对天然蛋白质改造的几个层次,对天然蛋白质的改造，可以笼统地分为3个层次：小改、中改和大改。 小改 是对天然蛋白质的一个或几个氨基酸残基进行修改。它往往利用点突变的技术，在维持蛋白质原有功能的基础上，改进某一些性质特点。例如，在核糖核酸酶内部引
25、入二硫键以增强其热稳定性。又如，修改与胰岛素分子间聚合作用有关的表面残基，使其更容易解离成有活性的单体分子，从而使这种胰岛素成为速效型药物。,对天然蛋白质改造的几个层次,中改 则是对蛋白质分子中某些结构单元或肽段进行分子裁剪，在不同的蛋白质分子之间替换结构单元，以期得到新的功能组合。一个成功的例子是将小鼠的抗体蛋白分子上识别抗原的部分，与人抗体分子上引起免疫反应的功能部分，通过基因拼接的办法结合在一起，得到的嵌合分子既具有鼠的抗体抗原专一性，能引起人的免疫反应、同时又不会引起人体排异反应。这个实验有重要的医学价值，可能提供一条途径，即利用鼠的抗体，通过蛋白质工程来生产能为人体所用的抗体。,对天
26、然蛋白质改造的几个层次,大改 更确切地说是重新设计与合成自然界本不存在的蛋白质分子。即从蛋白质的氨基酸组成和顺序出发，设计并制造出一个全新的蛋白质，并使之具有特定的空间结构和相应的功能。,“基因专家”请不要制造基因的神话,不久的几年内，可以得到一个完整的人类基因组序列。这是没有疑问的。但是，得到完整的序列虽相当容易，而要读懂它却是极其困难的。人类基因组中究竟有多少个基因？这些基因是如何调控的？这些基因都编码什么样的蛋白质？这些蛋白质又有什么样的结构和功能？彼此之间如何相互反应？只有完整地回答了这些问题，才可以说有了“一本完整地讲述人体构造和运转情况的指南”，而这些工作的难度，比用仪器自动测定基
27、因序列不知要难上多少倍，许多技术问题都还有待解决（比如我们就还无法根据DNA序列百分之百地确定基因，而这是人类基因组计划不能不做的），绝对不是“不久的几年内”就能完成的，甚至在我们的有生之年也未必能见到其完成。而要完整地了解蛋白质、基因的多态性，了解遗传的个体多样性，更是遥遥无期的事。,天生的不都是基因决定的,从事分子遗传学研究的人，往往有基因决定一切的印象，在小试管加入己知的基因，就可以预料会得到其结果，屡试不爽。但是，任何合格的研究者也都清楚，体外的实验结果不能简单地推广到体内，在试管中由基因决定的结果，在细胞中未必就如此。原因之一，是因为试管中的化学分子数目都是大大过量。均匀分布的，而细
28、胞中的化学分子数目则是有限的（比如体外一次实验所用的DNA数目多得难以数计，而每个细胞却只有两份DNA），局部的分子浓度不同，从而导致了细胞内的化学反应带有很大程度的随机性。,天生的不都是基因决定的,同一个细胞的后代属性各不相同（比如分裂期不同），主要是由于分子过程的随机性，而不是罕见的基因突变（同样是随机的）引起的。这种随机性，使得不论是基因决定论，还是环境决定论，甚至是基因加环境决定论，统而言之，一切的决定论，都无法成立。基因完全相同的细胞克隆，在完全相同的环境下发育，也会得到不尽相同的结果，这种现象在遗传学上，被称为“发育噪音”（developmental noisy）。,天生的不都是基
29、因决定的,目前关于大脑发育的前沿理论，是“选择理论”，其要点是，在大脑发育过程中，神经元随机地生长形成，随机地连接，在外界刺激下，有的连接被加强，有的则消失。这种以随机性为基础的选择性发育的结果，导致了一个人天生的性格和天赋，但是它既非决定于基因，也非决定于环境，发育过程的随机因素在其中占了相当大的比重。操纵基因是可能的，控制环境也是可能的，但是要控制细胞内分子反应的随机因素，却是不可能的。因此，要随心所欲地控制发育结果，也就是不可能的。,人类的生物学特征是既同一又多样的,遗传学家早就意识到人类的生物学特征是既同一又多样的。同一，是因为所有的现代人都是大约20万年前从同一个人群繁衍下来的，分布
30、各地的各个所谓种族也彼此杂居、通婚，因此人类身体特征的变异，并不具有明显的界限，而是一条连续的谱带。因此将人类划分为几个种族，只有社会、文化意义，没有生物学意义。我们没能发现任何决定种族的基因。有些等位基因（比如ABO血型基因）在不同的种族中的分布有所不同，但是那也只是频率的不同，并非质的不同。有时，我们也的确能够发现某种等位基因只存在于某个种族，比如线粒体DNA上有一个所谓“亚洲等位基因”，但是具有这种基因的人在那个种族中也只占了少数，比如在亚洲大陆只有18的人有这种“亚洲等位基因”。因此，我们无法根据基因既充分又必要地鉴定一个人所属的种族。,人类的生物学特征是既同一又多样的,另一方面，人类
31、又有着广泛的多样性。这种多样性，是通过群体、个体，而不是种族表现出来的。“种族”内部的群体之间、个体之间的差异，可能要远远大于“种族”之间的差异。没有两个人是相似的，甚至具有相同基因型的同卵孪生子的形态也有所不同。分子遗传学的研究也表明，不存在一个“纯种”的人。大约30的人体蛋白质是多态的，也就是有着不同一的序列和结构，而功能又属正常。每个人的体内，大约10的基因属于杂合的，通俗地说，每个人都是“10”的杂种。这是自然选择作用的结果，遗传上的杂合体要比纯合体有更强的适应能力和繁殖能力。,基因工程商业化特点,1. 技术密集型,（1）产品来源于实验室,Boyer教授是Genentech的副总裁。,
32、（2）科学家往往就是公司的领导人,1994年仅美国的总销售额40多亿美元。 1992年日本4000亿日元。 20世纪末6000亿美元。,2. 市场扩张迅速,美国1993年40多亿美元。 日本1997年5000多亿日元。 80年代初，加拿大联邦政府出资参与建立的Allelix生物技术公司，注册资本高达一亿美元！,3. 投入巨大,4. 风险太高,前期的资金投入是极其巨大的，非一般企业所能承受。,我国在“七五”和“八五”计划的10年间，仅就“基因重组人生长激素”一个项目的研发就先后投入了近1.5亿元人民币的经费。这仅仅是一个仿制型的二类新药，而且又仅仅是制药工艺的研发。长达10余年的研发过程，巨额资
33、金的投入，最终也并未获得高质量的“国产二类新药”。,全世界只有不超过100家生物技术公司有自己的产品。其中真正盈利的公司很少。,制药，动物胚胎移植技术，转基因动植物，农作物新品种等。,已取得的成果中60%是医学领域的。,7. 医学生物技术产业进展最快,6. 研究专一、产品专一,8. 专门为基因工程实验提供研发试剂的公司,5. 产品不断增加,基因工程不是发现，而是创造。,基工的魅力,只 有 想 不 到 的,没 有 办 不 到 的,思考？,1、基因工程技术的发展给人类带来的影响？ 2、基因工程技术在应用中存在的主要问题？ 3、基因工程技术的发展方向？作业： 1、基因工程的基本过程？ 2、获取目的基因的方法？ 3、DNA片段如何与载体连接?,
