1、实验三：从琼脂糖凝胶中回收并纯化 DNA 片段一 实验目的学习经琼脂糖凝胶电泳分离后回收并纯化 DNA 片段的方法二实验原理将 DNA 样品在琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切割下含目的DNA 片段的凝胶块；在高盐和促溶剂的作用下，琼脂糖聚合物中糖之间的氢键断裂而迅速溶解，DNA 就从胶基质中释放出来并选择性地吸附到球状的硅胶颗料或特定的柱子上；然后用高盐缓冲液洗涤除去残余的琼脂糖，再用含乙醇的缓冲液洗去盐和染料。最后用 TE 缓冲液或水将球状硅胶颗粒或柱子上的DNA 洗脱下来。回收纯化后的 DNA 可直接用于 DNA 的连接反应、标记反应、测序反应或 DNA 的微量注射等研究。 三实验材料1.水
2、浴锅、离心机、移液器2.PCR 扩增的 Rv1791 基因3.Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 （Taraka）四实验步骤（1）实验三中的 PCR 产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳。 （2）在紫外灯下切出含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。尽量切除不含目的 DNA 部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高 DNA回收率。切胶时不要将 DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防止 DNA 损伤。 （3）切碎胶块。胶块切碎后可以减少步骤 6 的胶块融化时间，提高DNA 的回收率。 （4）称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以 1 mg=1
3、 l 进行计算。 （5）向胶块中加入 3 倍凝胶体积的 胶块融化液 DR-I Buffer。（6）均匀混合后 75加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约 610min） 。（7）向上述胶块融化液中加入 DR-I Buffer 量的 1/2 体积量的 DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于 400 bp 的 DNA 片段时，应在此溶液中再加入终浓度为 20%的异丙醇。 （8）离心柱放入收集管中，将步骤 7 的溶液转移至离心柱中，12,000 rpm，1min，弃滤液。 如将滤液再加入离心柱中离心一次，可以提高 DNA 的回收率。 （9）将 500 l 的 Rinse A 加
4、入离心柱中，12,000 rpm，30s，弃滤液。（10）将 700 l 的 Rinse B 加入离心柱中， 12,000 rpm，30s，弃滤液。 （11）重复操作步骤 10，将离心柱放入收集管中，12,000 rpm，1min。 （12）将离心柱放入新的指形管中，在离心柱膜的中央处加入25l 的灭菌蒸馏水或 Elution Buffer，室温静置 1min。 注）把灭菌蒸馏水或 Elution Buffer 加热至 60使用时有利于提高洗脱效率。 （13）12,000 rpm，1min，洗脱 DNA。 五实验结果根据电泳结果，描述对 DNA 片段回收的结果与效率。M:DL2000 DNA
5、Marker/bp44 号：PCR 胶回收 Rv1791 基因失败原因：在实验的第 12 步骤中将所得溶液弃置了，PCR 扩增所得的 DNA 被弃置，导致最终没有得到 DNA 片段。因此电泳图上无亮条带，回收率极低，几乎无。三 思考题凝胶抽提法回收纯化 DNA 片段的原理是什么?将 DNA 样品在琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切割下含目的DNA 片段的凝胶块；在高盐和促溶剂的作用下，琼脂糖聚合物中糖之间的氢键断裂而迅速溶解，DNA 就从胶基质中释放出来并选择性地吸附到球状的硅胶颗料或特定的柱子上；然后用高盐缓冲液洗涤除去残余的琼脂糖，再用含乙醇的缓冲液洗去盐和染料。最后用 TE 缓冲液或水将球状硅胶颗粒或柱子上的DNA 洗脱下来。回收纯化后的 DNA 可直接用于 DNA 的连接反应、标记反应、测序反应或 DNA 的微量注射等研究。
