1、1实验一 大型海藻种类形态观察（4 学时第八周）一、实验目的了解海洋藻类-大型海藻与微藻的形态与分类。二、实验材料及用具1、实验材料：1）大型海藻标本（学院标本室） ；2）海带孢子体（可用干海带泡发） ，江篱（海洋学院附近打捞） ；（取一部分冻存于-20 冰箱，作为叶绿素提取实验的材料）2、实验器材：显微镜、胶头滴管（每瓶藻一支） 、盖玻片、载玻片、刀片（做海藻切片） 。4、试剂：70%乙醇（每组一瓶）三、实验步骤1、大型海藻标本观察；将标本馆的拉丁文名抄录下来，网上检索图片和分类。2、海带的外部形态观察：藻体明显分为固着器、柄部和叶片，在叶片中央有两条平行纵走的浅沟，孢子体幼龄期叶面平滑，小
2、海带期叶片出现凹凸现象，大海带期叶面则平直宽厚。3、海带的内部构造：用徒手切片的方法，取一小块孢子体进行横切片，在显微镜下观察：孢子体的柄和叶均分为表层、皮层和髓部。同样取一小块孢子体进行纵切片，在显微镜下观察：表皮层由 1-2 层排列紧密的小细胞组成，外皮层细胞间分布 1-2 层粘液腔，其腔内有分泌细胞，髓丝细胞一端膨大为喇叭花，分生细胞位于叶片与柄之间。4、江蓠的内部构造观察：2江蓠的纵切面。江蓠的横切面。江蓠囊果横切面。5、紫菜的形态与构造：干紫菜先用水浸泡散开，再进行观察。固着器：由根丝集合而成。叶状体：由一层或两层细胞构成。柄：叶状体基部与固着器之间的部分。四、作业：1、绘制大型海藻
3、图：选 5 个标本，注明拉丁文名，简要说明其生物学特性（利用拉丁文名进行网上检索） 。2、绘出海带和江篱的内部构造，紫菜的外形。附 1：江篱与海带的内部构造3图 1. 江篱藻体的内部构造A.藻体横切面观；B.藻体纵切面观；1 表皮；2 髓部细胞 3 表皮细胞图 2. 海带构造A.海带孢子体横切面；B.髓部，C.示喇叭丝；皮层部分横切面，示粘液腔道形成的时期；D.成体横切面，示粘液腔道； co 皮层；e 分泌细胞； hg 藻丝；me 髓部；m 表面分生细胞；s 分泌腔；v.b.f 结合的喇叭丝4实验二 微型海藻形态观察和培养（4 学时，第九周）一、实验目的观察几种重要经济微藻的形态特征，几种掌握
4、单细胞微藻的实验室培养方法，细胞生长曲线观察。二、实验材料及用具1、实验材料：小球藻、扁藻、等鞭金藻、角毛藻、骨条藻、茧形藻、池塘水样等微藻。2、实验仪器：电炉、恒温干燥箱、灭菌锅、pH 计、可见分光光度计、血球计数板3、实验器材：500ml 试剂瓶（每组 5 个） ；0.45m 的滤膜（一个） ；抽滤装置( 或针管 )；玻棒、500ml 烧杯、50ml 容量瓶（每组一个） ；250ml 锥形瓶（每组 2 个） 、牛皮纸、细绵绳4、试剂：蒸馏水、消毒海水、各种试剂（见培养基配方） ，微藻培养母液三、实验步骤1、微藻形态观察：分别取各种微藻水样置于载玻片上，盖上盖玻片，于显微镜下观察。先用 10
5、 倍镜观察，然后转换物镜转换器用 40 倍观察。2、培养基母液配制（配方见附 2）：（提前配好，有兴趣的同学可与实验老师王老师联系好时间，学习配制）1000 倍培养基母液（强调维生素母液的配制方法） 。配方见附 1。3、培养微藻的容器、工具及用水的消毒（提前准备）：（1）培养微藻所用的容器、工具应用洗刷干净后晾干，放置恒温干燥箱中加热，120恒温 1 小时以上，自然冷却备用。（2）加热煮沸消毒海水冷却至室温后备用。4、配制微藻培养液。按照母液配制比例把母液加入消毒海水，配制培养液（例如，1000 倍母液，则每升消毒海水中加入 1 毫升母液，摇晃均匀，就5成了培养液） 。5、接种：取两种微藻，各
6、按 1/31/5 接种（即把 1 份藻种加入 35 份培养液中） 。6、培养、管理。将接种好的微藻置于适宜的条件下培养，每天摇晃 1-2 次，。7、藻细胞密度计数（方法见附 3） 。分光光度计测定吸光值或血球计数板计数藻细胞密度。不同种类的微藻所选用的波长不一样，一般绿藻门波长为720-750，金藻门、硅藻门波长为 420。8、本实验采用分光光度计每 2 天测定一次，培养时间为横坐标，藻细胞的OD 值为纵坐标，绘制生长曲线。培养两周。四、作业：1、绘制观察到的微藻的形态图。2、通过哪些具体措施使培养基无菌？3、为何配制母液？配制培养基时，为何要等消毒海水冷却后再加母液？4、EDTA 的作用？5
7、.以培养时间为横坐标，相对应藻液的 OD 值为纵坐标，作图。6、计算每瓶藻的培养 6 天的生长速率，公式如下：K =（lnN2 lnN1）/（ t2 - t1） （1）T = 0.6931/K （2）其中：K 为相对生长速率；t1 、t2 为对应的培养时间；N1 和 N2 分别为t1、t2 时的细胞密度 (微藻用 OD 值，江篱用重量)；T 为细胞的平均倍增时间。t1 就是刚放入培养箱的那天，计算培养 6 天后（即 t2-t1=6,lnN1、lnN2 分别为培养第一天和第六天的 OD 值的自然对数）的 K 值，再计算一个从培养第1 天到最后 1 天的 K 值，分别以表格的形式表示 。6附 1：
8、单细胞微藻的培养基配方（一）宁波 3 号培养基配方试剂名称 重量 试剂名称 重量（mg）NaNO3 100 mg KH2PO4 10 mgFeSO4 2.5 mg MnSO4 0.25 mgNa2-EDTA 10 mg 维生素 B1 6g维生素 B12 0.05g 自然海水 1000ml （二）F/2 (+ Si)培养基母液的配制1.A 液 500 ml 1000 倍NaNO3 37.5 g; NaH2PO4 2.5 g2.B 液 500 ml 1000 倍Fe-EDTA 2.5 g (FeCl3 1.6 g + EDTA 0.9 g)3.C 液 500 ml 1000 倍 Na2SiO3.9
9、H2O 10 g4.D 液 500 ml 1000 倍 盐酸硫铵素(VB1) 5 mg (试剂 50 mg/ml 取 100 l)Biotin VH 0.025 mg (试剂 0.1 mg/ml 取 250 l)VB12 0.025 mg (试剂 0.25 mg/ml 取 100 l)先用维生素分别用纯水溶解混合，稀 HCl 将 pH 调到 4.55.0，最后用纯水稀释至 1 升。膜过滤后冰冻保存。5.E 液 500 ml 1000 倍CuSO4.5H2O 0.0098 mgZnSO4.7H2O 0.022 mgCaCl2.6H2O 0.01 mgMgCl2.4H2O 0.180 mgNa2M
10、oO4.2H2O 0.0063 mg1000 ml (1 升) F/2 (+ Si)培养基 = 1000 ml (1 升)过滤灭菌海水 + 1ml A 液 + 1ml B 液+ 1ml D 液+ 1ml E 液 (+ 1ml C 液)7附 3：单细胞藻类的定量方法（一） 重量测定法：湿重法；干重法（二） 个体计数法：水滴计数法；血球计数板计数法；血球计数板计数方法：放大8图 3. 血球计数板 1 搅拌：由于藻类细胞在培养液中分布不均匀，所以在取产前必须进行搅拌，搅拌后立即取样。2 固定、稀释：运动细胞需加碘液杀死才能计数。如细胞浓度过大，计数困难，需把水样稀释到适宜的程度。3 计数板与盖玻片洗
11、净擦干盖好盖玻片摇荡藻液吸取藻液（干的平口微吸管）迅速把吸管放在计数板上的盖玻片边缘处，轻压橡皮头，使藻液流入计数板内1 分钟后低倍镜下计数计数任何对角两大格（加盖玻片后每一大格即形成一个体积为 0.1 立方毫米的空间） ，然后取其平均值。每个样品须重复计数两次。91 毫升水体藻细胞计算平均值10,000藻稀释倍数鲁哥氏液（Lugols Solution）又称碘液，常用的配方是：将 6 克的碘化钾溶于20 毫升水中，待完全溶解后加入 4 克碘，摇荡，待碘完全溶解后，加入 80 毫升蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内。（三） 分光光度计定量法微藻的细胞密度在某一范围内与分光光度计在特定波长下的 OD 值
12、的大小成正比关系，因此，可用分光光度计直接定量。测定步骤：1. 预热分光光度计约 20min，选择波长（绿藻门 720-750，硅藻门、金藻门 420），用培养液作为參比，调零。2分别测定待测藻液的 OD 值。3.以培养时间为横坐标，相对应藻液的 OD 值为纵坐标，作图。实验三 藻类细胞叶绿素的提取和细胞色素的观察（4 学时，第十一周）注：第十周继续培养微藻一、实验目的掌握大型和微型海藻叶绿素测定方法。观察比较不同门藻类的叶绿素的吸10收光谱。叶绿素含量是衡量大型海藻生长状态的指标之一。浮游植物叶绿素含量，可用来初步估量浮游植物的光合作用能力，并进行估量水域初级生产力。同样也适用于实验室单种培
13、养试验的定量方面。二、实验材料及用具1、实验材料：海带、江篱2、实验器材：研钵（每组一套） 、15ml 刻度试管（每组 2 支，尽量使用玻璃试管） 、剪刀、分光光度计、天平、叶绿素荧光观察箱（一端带光源的纸箱） 、台式离心机（不用控温） 、胶头滴管（每组 2 支） 、10ml 左右玻璃试管（每组 2支）4、试剂：90%丙酮（分析纯） 、MgCO 3三、实验步骤1、取样：清洗海带和江篱，剪取藻体 0.05g 左右(记录准确的重量)。2、研磨和提取：加入 23ml 的 90丙酮和 1 小匙 MgCO3，研磨，在弱光下研磨 1 到 2min，再用 5ml 的 90丙酮把杵上和研磨管内的东西洗入 15
14、ml 的有螺旋盖的离心管内，静置于暗处 10min，使色素充分被提取。3、离心（2000g，5min）或静置，使固液分离。4、测定：小心移取将上清液放入玻璃试管内，在分光光度计上，用 1cm的比色皿分别读取 750nm、663nm、645nm、630nm 波长的吸光度，并以 90的丙酮作校正吸光度测定。6、计算：分别从 663、645、630nm 时的光密度值，减去 750nm 时的光密度值，再除以液槽光程（厘米） ，即为 D663、D645、D630 的值。下式计算叶绿素在 90丙酮中的含量。Chla（g/ml）=11.64*D663-2.16*D645+0.1D630Chlb（g/ml）=3.94*D663+20.97*D645-3.66D630Chlc（g/ml）=5.53*D663-14.81*D645+54.22D6307、叶绿素吸收光谱的测定：将提取的叶绿素放于(石英)比色皿中，用紫外分光光度计测定 400nm-750nm 波段的吸收光谱。11三、作业：1、 计算几种藻类的叶绿素含量2、 思考：叶绿素提取过程中为何要避光？为何加 MgCO3？
