1、一些分子生物学实验小技术汇编点击次数：284 发布日期：2008-12-10 仅供参考，谢绝转载，否则责任自负1保存菌种保存菌种或长时间放置的培养板应先划板活化菌种，挑取分隔良好的单 克隆接种于 2-10 ml 中（如菌种含质粒则应加抗生素）摄氏度快摇 小时，按 0.1%-0.5% 比例转种，培养基的量不应超过锥瓶的 0.25 容量，以 保证足够的通气。用 OD.600 测菌密度时，读数值在 0.1-0.5 范围内为线性相关，超过该范围的应作稀释。通常升的过夜培养 12-16h，湿重为 3 g 左右，密度往往是 3-4 109 个细胞每毫升培养物离心收菌后可在-20 摄氏度冻存数周。 2TSS
2、 法快速转化大肠杆菌 A过夜培养物转种后 27 拚度快摇约 205hrs 至 O.D 值为 0.3 左右。 B取ml 菌液离心收菌，加入 0.1ml 冰浴的 1 TSS 液轻轻吸打悬起细胞。（可以放-70 摄氏度冻存半年）B 、可以取 0.1ml 菌液加入 0.1ml 冰浴的 2 TSS 混匀，该方法只适于做质粒转化，如做连接产物转化请按做。 C加 100pg-10ngDNA 混匀。冰浴 10min ，室温放置 10 分钟再次冰浴 10mins. D加 1ml LB，37 摄氏度 1 小时。 E涂板。转化效率 106-108 对于 DH52，600 ，等转化效率在 107-108 以上）。 快
3、速鉴定插入外源片段的克隆 3快速鉴定插入外源片段的克隆（从转化子中筛选重组名）由于载体自身环化会产生大量的不含插入片段的转化子，给鉴定重组子带来一些麻烦。通常用双酶切（即插入片段两端酶切位点不同）载体去磷酸化，或者蓝白斑筛选有助于减少这种麻烦，但有的时候还是会需要大量筛选转化子中的重组子。 AEpicertre 公司提供一种快速连接和筛选试剂盒。可在转化子分布不是太密时（较低的铺板密度）待菌长到较大时，用灭菌牙签沾很少量菌点板（转到新的筛选平板上以便给菌落编号），将剩下的菌全部挑起转至已加入快速筛选试剂的 epperdorf 管中，混句，补加试剂 2 后即可准备上样跑电泳，鉴定是否插入外源片段
4、。 B转化子密度很高时可用灭菌牙莶沾取菌落，点板编号后插入含 1mlLB （含抗生素）的小试管中，加盖，37 摄氏度快摇 3-5hrs 至 LB 浑浊（肉眼观察很明显长菌），转至 epperdorf 管中离心收菌，去上清。加入 15ml 含 RNAse A 和溴酚蓝（溴酚蓝也可以最后上样再加）的，振荡以充分悬浮细胞，加入 15ml酚一氯仿剧烈振荡 5-10 秒，离心，取上清即可上样电泳。注意这时电泳槽中 buffer 的量应比胶面高 2mm ，上样时要小心，避免上清的扩散。胶不宜太厚。如果细菌太多加酚后振荡应为液状，如成固体状就是太多菌了）则要相应增加和酚氯仿量。另外，我们推荐 C公司或、公司
5、的电泳槽，这种电泳槽的承胶底座是透紫外的，当制胶时加入即可在电泳的过程中观察电泳情况。在大量筛选时往往要同时跑很多的样品，制较大的胶，在量较少的情况下往往需用短波下紫外观察以便得到更清楚的结果。用这种电泳板即可直接把承胶底座连胶一起放在下紫外灯上（或凝胶成像系统中），不需要将胶推下来或倒置。在需要时即可继续电泳。 4当找到可能的重组质粒且条带清晰时可直接切下含 DNA 的凝胶条带，用胶回收 DNA 的方法回收质粒并进行酶切鉴定，如果 DNA 量太少则需重提质粒。 用 QIAprep Miniprep Spin 小量提质粒注意以下事项可提高得率A用含抗生素的培养基培养细菌会有较高的得率。 B收菌
6、时用 tips 吸干净残余的培养基上清。 C加入后应充分振荡以完全打散悬浮细胞，特别是多次离心收菌的情况下较难打散细菌，可用 tips 反复吸打因为残留的小块菌团会严重影响得率和 DNA 的质量。 D加入后立即轻轻摇匀，可反复倒转 epperdorf 管 4-6 次充分混匀菌数较多时可静置不超过 5 分钟，以便充分裂解提高得率，超过 5 分钟的会降低质粒质量。甚至可能出现部分质粒不可逆的变性的情况，可能在电泳时得到一条酶切不动的质粒条带。 E加入后立即轻轻混匀，可反复倒转 epperdorf 管 5-7 次以充分混匀。菌数较多时可静置几分钟以便质粒充分复性。 F离心后上清液上柱，注意不要将悬浮
7、的细胞碎片（如果有的话）加入柱中，如已在柱中请吸出。我们建议一定用 PB 洗柱，特别是菌数较多，或菌株糖蛋白较多的情况，以保证 DNA 的质量。 G对于较大的质粒，（10Kb ），请 70 摄氏度预热、洗脱 buffer 或 ddH2O 以提高得率，对于拷贝数不高的情况可以用 50ml 洗脱 buffer 或 ddH2O 分别洗 2 次，如果拷贝数高的可用 100ml.静置 1 分钟后再离心，有助提高得率，buffer 或 H2O 应加在膜中央而非管壁上。 5有关融合蛋白表达载体的克隆 在构建融含蛋白表达载体时除了要注意插入片段的方向、读码框架与载体保持一致外，注意以下问题可能会减少一些不必要
8、的麻烦，当外源片的插入载体起始密码的后面，另一个基因的前面时，注意检查插入后基因的两端是否引入了新的终止密码，特别是用到 Klenow mung bean 核酸酶，T4 Polymerase 补齐，去粘末端等技术调整读码框时或不同酶切位点粘端连接时要注意。如 XbaI 识别序列隐含终止密码，调整码框时就要注意，又如 BamH I 酶切粘端为 GATCC 补平后如果接到 T 后面就有可能形成 TGATCC 这种隐含终止密码的情况。（还有外源基因本身不可带终止密码）另外要注意启动子后面避免出现几个靠近的不同框架的 ATG ，以减少对表达的影响。如果插入片段插到载体终止密码前和另一个基因后面，则只用
9、注意插入片段前方是否有终止密码即可。 6关于酶切 A找不到适合的酶切位点。由于各厂家不定期的推出新的限制性内切酶品种，这些酶切识别序列可能尚未在有关 Catalog 上出现，用现有的软件也查不到这些酶切点，如 New England Biolabs 公司前一段时间刚推出了 20 多种新的内切酶。请随时向各厂家或供应商查询，并记得将新的品种加入到您的记录中以便查阅，这些新的内切酶有可能正是您要找的呢。 B在文献上找到的内切酶在厂家目录上找不到。由于来源不同，许多识别序列，酶切点完全本同的酶会有不同的名字，各供应商目录往往会有相应的附录以供用户查询，比如在 New England Biolabs
10、的Catalog 后面 20 项或基因有限公司 2000Catalag 前面都附有相当完整的内切酶列表（含 1999 年以前绝大部分商品化的酶），从左边一栏寻找你已知的酶的名字，找到后可以查出相应的识别序列，各种同功酶的名称，酶在 NEB 厂家所用的名称和目录号等。另外也可以通过已知酶的识别序列在相应的表中找到相应的酶名称。当然这些表可能不含最新发现的酶。 CDam Den 甲基化对酶切点的影响。有时用试剂盒纯化的质粒用别的酶都切得动，用 Bcl I ，等酶就是切不动。原因在于多数实验室常用的 Ecoli 菌株都有甲基化的功能，而 BclI 是一个甲基化敏感的酶。当其识别序列被甲基化后 Bcl
11、I 就出现切不动的情况。而 Bam HI 则对甲基化不敏感，所以甲基化与否都照切不误。当你要用 BclI 这类切点时，请选用甲基化缺陷的 Ecoli 菌株如 GM119 或其他菌种。有的内切酶对甲基化敏感与否取决于其识别序列两端的碱基，详细资料请参考厂家目录的有关附录，如 NEB 目录 268 、269 页。 D同进进行双酶切要注意：任何时候 2 种酶的总量不能超过反应体系的 0.1双酶切时如果两种酶反应温度一致而 buffer 不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同 buffer 中的活力表（NEB 目录 251 ）页，如果有一种 buffer 能 2 使种酶的活力都超
12、过 70% 的话，即可用这种 buffer. 如果两种酶厂家不同无法查时可比较其 buffer 成份，相似的话可各取一半中和。 如果 2 个酶 buffer 成份相差较大或 2 个酶的反应温度不同则必需分别做酶切。厂家目录一般都会有相应的附录以供查询各种酶的反应温度。 第一个酶切后可以电泳确证酶切完全后从胶中回收 DNA 再进行下次酶切也可以在第一个酶切后用 PCR 产物回收试剂盒或 Nucleotide Removal Kit 纯化酶切样，保留少量做电泳分析之用后再进行下一次酶切。还有一种屯化管（eppendorf 等厂家有售），将酶切样加入后离心，盐等成份被甩掉而核酸则被截留在柱子中间的膜
13、上，加入 ddH2O 离心洗涤后加几微升在膜上，将柱子反转插入新的 epperdorf 管上离心即可将 DNA 片段离下来，做下一次酶切。 特别注意，双酶切载体时如果 2 个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序，因为不同的内切酶对其识别位点两端碱基数目要求不同，有的酶要求识别序列两端有多个碱基的必须先切，比如 LITMUS29 中先切BamHI 再切 Hind 时就会出现切不动的情况。更详细的数据可参考相应的附录，如 NEB 公司目录的 259 页。 E设计合成引物时加入酶切点往往为后继的实验带来很多方便，比如 PRC 产物经酶切后可以定向克隆到载体中，但在设计时需注意不同的限制性内切酶对其识别
14、位点两端的碱基数目要求不同。例如 HindCla ，要求其识别序列 5 端至少有多个碱基，这个酶才能切动，有的内切酶在两端碱基不同时切割效率也不同，设计引物时要特别注意。有关数据可查询各供应商附录表，如 NEB 公司第 258-259 页。 F小量酶切时用较小的管化 1.5 的管好，可以减少因为蒸发造成的体积减少，浓度改变。 7 、 有些酶切补齐后再连接会产生新的酶切位点可以用来验证是否补齐连接成功，例如 Bam HI 酶切补齐再连接后产生的序列可以被 cla ，pn，Taq 所切动。详细资料可查询供应商的附录，如8 、 有些酶的识别位点不同但产生的粘端是匹配的，可以直接连接，如 Bcl I
15、，Bam HI 和gl ，酶切产生的粘端就是匹配的，可以直接连接。详细资料可参考供应商的附录如 NEB 目录的9 、 各供应商送货时往往会提供冰袋，在室温下将化冻的大冰袋平整的一面整齐地插入 1.5ml 或 0.5ml 、0.2ml 的废弃离心管；或将几个小冰袋（化冻后）填料塞入一个小泡沫盒中压实，再插入各种大小的废管，放在-20 摄氏度冻24 小时后了取出，拔出插入的废管（可加点热水以助拔管）即可做成一个科易冰盒，可在室温下保持 6-24 小时的低温呢（平时要在-20 摄氏度放置）在制冰机有问题或停电时就不用怕了。 10、用 CLP 的10ml/200ml 两用 tips 盒，这种盒的芯可调
16、的，可以放 10ml 的小 tips ，也可调整为放ml tip 的盒，根据需要随时转换非常方便。8双酶切小技巧 A任何时候 2 种酶的总量不能超过反应体系的 1/10 体积。 B双酶切时如果两种酶反应温度一致而 buffer 不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同 buffer 中的活力表（也可以向 客户服务部索取），如果有一种 buffer 能同时使 2 种酶的活力都超过 70% 的话，就可以用这种 buffer 作为反应 buffer. 如果两种酶厂家不同无法查时可比较其 buffer 成份，相似的话可以考虑各取一半中和。 C如果 2 种酶的 buffer 成份相
17、差较大或 2 种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。第 1 种酶切后要考虑用酚抽、电泳或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。有的酶可以用加热使之失活，有的则不行，这些信息也可以在有关附录中查询，也可以向 客户服务部索取。 D 第一次酶切后通过电泳确证酶切完全后可以从胶中回收 DNA 片段再进行下次酶切，也可以在第一个酶切后直接用 PCR 产物回收试剂盒或 Nucleotide Removal Kit 纯化酶切样（只需 5 分钟），保留少量样品做电泳分析之用，再进行下一次酶切。还可以用一种离心纯化管或叫做离心浓缩管（Eppendorf
18、，S&S 等厂家有售），将酶切样加入后离心，盐等成份被过滤掉而核酸则被截留在柱子中间的膜上，加入适量 ddH2O ，离心以洗去膜上残留的杂质，再加几微升 ddH2O 在膜上，将柱子反转插入新的 eppendorf 管上，离心，即可将 DNA 片段离下来，做下一次酶切。 E特别注意：在双酶切载体时如果 2 个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。比如质粒 pLITMUS29 的多克隆位点中 BamH I 旁边有HindIII 位点，如果先切 Ba
19、mH I 再切 HindIII 时就会出现 HindIII 切不动的情况，但是反过来就没问题。更详细的数据可参考相应的附录，也可以向 客户服务部索取。 9 Dam Dcm 甲基化对酶切的影响。 有时质粒用别的酶都切得动，用 Bcl I 、Cla I 等酶就是切不动。原因可能在于多数实验室常用的E.coli 菌株都有甲基化的功能，而 BclI 是一个对甲基化敏感的酶。当其识别序列被甲基化后 BclI 就出现切不动的情况。而 BamH I 则对甲基化不敏感，所以甲基化与否都照切不误。当你要用 BclI 这类切点时，请选用甲基化缺陷的 Ecoli 菌株如 GM119 或其他菌种。有的内切酶对甲基化
20、敏感与否取决于其识别序列两端的碱基，例如 Cla I ，3 端相连的碱基为 C 时就会对甲基化敏感。这样的酶有好几种，详细资料请参考厂家目录的有关附录，或向 客户服务部索取。小玩意 1 、 各供应商送货时往往会提供冰袋，在室温下将化冻的大冰袋平整的一面整齐地插入 1.5ml 或 0.5ml 、0.2ml 的废弃离心管；或将几个化冻后的小冰袋填料塞入一个小泡沫盒中压实，再插入各种大小的试管，放在-20 摄氏度下冻 24 小时后取出，拔出插入的废管（可加点热水以助拔管）即可做成一个简易冰盒，可在室温下保持 6-24 小时的低温呢（不用时要放在-20 摄氏度下存放）。在制冰机有问题或临时停电时就不用怕了。 2 、有一种 10l/200 l 两用 tips 盒，这种盒的芯可调的，可以放 10l 的小 tips ，也可调整为放200 l 的 tips，根据需要随时转换，非常方便。
