1、 酶切、片段回收与连接 第 1 页酶切、片段回收与连接黄华如（生命科学学院，生技 091，29 号）摘要：实验用 bt2 质粒和 pet 质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证 PCR 验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收基因文库的建立为重组 DNA 研究工作提供了方便的、有
2、意义的基因。构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体 DNA 分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。基因工程(gene engineering)是 20 世纪 70 年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质 DNA 分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。基因工程中的关键一步是将目的基因与 DNA 载体连接成重组 DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。近年来，建立了许多方法来筛选重组
3、子，其中较为常用的是利用 a 互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选 1oL 一互补是指 Ecoli B 一半乳糖苷酶的两个无活性片段(N 端片段和 c 端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。现在使用的许多质粒载体都带有一个 Ecoli DNA 的短片段，其中含有 B半乳糖苷酶 N 端 146个氨基酸的编码信息及调控序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源 DNA 片段。这种类型的载体适用于可编码 B半乳糖苷酶 c 端部分的宿主细胞。尽管宿主和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物 X-gal 的培养基中形成蓝色菌落。当外源 DNA 片段插
4、入到质粒的多克隆位点后，导致N 端片段丧失仪互补能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色菌落 1。1 材料与设备1.1 试供材料大肠杆菌、质粒 DNA1.2 试剂准备质粒 DNA 回收试剂盒、灭菌水、琼脂糖、BamHI、HindIII、T 4 连接酶、T 4 Buffer、LB 固体培养基、等1.3 实验设备及用具高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。2 实验步骤2.1 提取质粒 DNA这个步骤由老师完成2.2 酶切酶切、片段回收与连接 第 2 页表一：质粒（bt 2）双酶切体系 表二：质
5、粒（pet）双酶切体系试剂 用量 试剂 用量Buffer 2ul Buffer 2ul质粒（bt 2） 4ul 质粒（pet ） 4ulBam1HI 1ul Bam1HI 1ulHindIII 1ul HindIII 1ulWater 12ul Water 12ul总体系 20ul 总体系 20ul酶切 2h 以上，酶切结束后，用 1.2%琼脂糖检查双酶切效果。2.3 片段回收1) 使用 TAE 缓冲液或 TBE 缓冲液制作琼脂糖凝胶，然对目的 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳。2) 在紫外灯下切出含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的 DNA 部分的凝
6、胶，尽量减小凝胶体积，提高 DNA 回收率。胶块超过 300mg 时，请使用多个 Column 进行回收，否则严重影响收率。注）切胶时请注意不要将 DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防止 DNA 损伤。3) 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤 6 的胶块融化时间，提高 DNA 的回收率。4) 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以 1mg=1ul 进行计算。5) 向凝胶中加入胶块融化液 Buffer GM，Buffer GM 的加量如下表：凝胶浓度 Buffer GM 使用量1.0% 3 个凝胶体积量1.0%-1.5% 4 个凝胶体积量1.5%-2.0% 5 个凝胶体积量6) 均匀混合
7、后室温 15-25 融化凝胶。此时应间断震荡混合，是胶块融化（约 5-10 分钟） 。7) 当凝胶完全融化后，观察融胶液的颜色，如果融胶液颜色有黄色变为橙色或粉色，向上述胶块融化液中加入 10ul 3 M 醋酸钠溶液（pH5.2） ，均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于 400bp 的 DNA 片段时，应在此溶液中再加入终浓度为 20%的异丙醇。8) 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。9) 将上述操作步骤 7 的溶液转移至 Spin Column 中，12,000rpm 离心 1 分钟，弃滤液。10) 将 700ul 的 Buffer WB 加入
8、Spin Column 中，室温 12,000rpm 离心 30 秒钟，弃滤液。11) 重复操作步骤 10。12) 将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，室温 12,000rpm 离心 1 分钟。13) 将 Spin Column 安置于新的 1.5ml 的离心管上，在 Spin Column 膜的中央处加入 30ul的灭菌蒸馏水或 Elintion Buffer，室温静置 1 分钟。14) 室温 12,000rpm 离心 1 分钟洗脱 DNA。2.4 T4 连接酶连接表三：T 4 连接酶连接体系试剂 用量回收 pet 质粒 4ul回收 bt2 质粒 4ulT
9、4 连接酶 1ulT4 Buffer 1ul酶切、片段回收与连接 第 3 页总 10ul放置 4C 连接过夜2.5 转化大肠杆菌质粒 DNA 转化大肠杆菌方法：1) 把感受态细胞置于冰中；2) 把 50ul 的感受态细胞转至连接的 DNA 中（10ng 一下，昏匀） ；3) 冰中放置 30 分钟；4) 42C 放置 45-60 秒；5) 冰中放置 2-3 分钟；6) 加入 37C 预热更好的 soc 培养基，使终体积 1ml；7) 37C 振荡培养 1 小时（ 160-225r）8) 取适量的菌液涂布琼脂糖培养基9) 37C 过夜培养2.6 验证（PCR）表四：验证 PCR 体系试剂 用量10
10、xBuffer 2uldNTP 2.5ul引物 1 0.5引物 2 0.5ulTaq 酶 0.5ul加蒸馏水至 25ulPCR 条件：944min，9445s，51 45s，721m30s，30 个循环，7210min。3 结果分析3.1 酶切结果（M：Maker2000；B：bt 2 质粒；P ：pet 质粒；1，2，3：每组实验）图 1 两种质粒的双酶切结果在图 1 中可以清晰的看到，bt 2 质粒被酶 Bam1HI 和酶 HindIII 切成两条带，而 pet 质粒则被切成一条带，在 bt2 质粒中，第一条较粗的带为目的基因，第二条是双酶切切除目的基因后剩下的基因；在 pet 质粒中，可
11、以看到的只有一条带，其实在双酶切下，pet 质粒也会有两条带的，只不过是切完后的两段片段的质量差不多，在电泳的时候没能跑开来。由于 bt2 和 pet 质粒都是用相同的两种酶剪切，所以在在 bt2 质粒和 pet 质粒剪切下来的目的片段和载体片段都形成了相同的粘性末端。我们每组的结果都很清晰很成功，只要成功的地方很有可能是 bt2 质粒和 pet 质粒的质量都非常高。3.2 转化大肠杆菌结果酶切、片段回收与连接 第 4 页图 2 质粒 DNA 转化大肠杆菌图 2 中可以清晰的看到白色的斑点，转化的大肠杆菌。由于目的基因中含有一些抗性基因，如，Amp、潮霉素等，而在培养基中也加有这如 Amp、等
12、的抗生素，能在培养基生长的细菌，它们的基因组里面应该是含有抗性基因的。从图中可以看到很多白色的斑点，能够正常生长的大肠杆菌，这些大肠杆菌中成功的转入了含有 bt2 质粒的目的基因。但是，这些白色的斑也有可能是假阳性，为了确定目的基因是否真正的转入大肠杆菌，还需要做PCR 验证。3.3 验证的 PCR 结果（ M：maker2000；1-6：本组大肠杆菌结果；7-8 ：老师提供大肠杆菌结果）图 3 验证转化大肠杆菌 PCR 电泳图谱图 3 中，白色方框内的为 1 班 6 组的结果，左边的六个孔是点用自己转化大肠杆菌PCR 的结果产物，右边两个点是老师提供转化大肠杆菌 PCR 的产物，可以看到，我
13、们自己转化的大肠柑橘在电泳图中没有跑出来，而老师提供的大肠杆菌就可以跑出来。说明了我们自己转化的大肠杆菌虽然在抗生素培养基生存，但那是假阳性的大肠杆菌，而老师提供的大肠杆菌是成功转入了目的基因的阳性大肠杆菌。4 讨论与分析4.1 讨论本实验所涉及的内容和步骤都非常多，有很多环节都是要注意的，这关系到整个实验的成功与失败，例如下面的这些：1) 感受态细胞非常脆弱，要轻拿轻放，不能过分的摇晃，更不能激烈震荡；2) 在做酶切和 PCR 过程中，尽量在冰上操作，保持低温环境；3) 在进行加样的时候要有耐心，因为进行双酶切时加入的物品的量都是比较少的，所以要特别留意。特别是在把取出的样品加入到 PCR
14、管的时候更要注意，因为量太少，所以要粘着 PCR 的管壁来放样；4) 转化实验中所使用的玻璃仪器，微量吸管，离心管等应该彻底清洗干净，并进行高温高压消毒灭菌，表面去污剂、化学试剂的污染残留会大大减低转化率。微量吸管应该剪去尖端扩大口径。酶切、片段回收与连接 第 5 页4.2 分析质粒的重组和转化是基因工程的关键所在，所谓的基因的工程就是将真核细胞的基因能在原核细胞中成功地表达，这个实验通过质粒的重组和转化，这对基因工程的研究很有帮助的。在基因工程中，目的基因获取的途径有很多：从基因文库或 cDNA 文库中获取所需的目的基因；更具目的基因的序列来合成所需的目的片段；通过 PCR 扩增技术来获得所需的目的片段。而本实验就是通过 PCR 扩增技术来获取质粒 DNA 的，在进行电泳检测目的基因，可能会出现无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性、假阴性的现象。参考文献：1 梁红，梁雪莲. 生物技术综合实验教程M. 北京：化学工业出版社， 2010.
