1、吸附层析 分配层析 凝胶层析 离子交换层析 亲和层析 纸层析 薄层层析,液 相 层 析 方 法,离 子 交 换 层 析 法,思考题： 离子交换层析的原理？ 离子交换剂由哪三部分组成？它们的结合形式？ 如何判断蛋白质的电性，如何根据电性选择交换剂？ 离子交换层析的操作步骤？ 离子交换层析的应用？,原理：样品进入离子交换柱后，与离子交换剂无亲和力的样品被洗脱下来，余下的样品均结合在交换剂上，利用其样品表面电荷性质的不同，与交换剂的亲和力也各不相同，利用不同强度的离子溶液，将其分别洗脱下来达到分离、纯化样品的目的。 离子交换剂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团。,离 子 交 换 层
2、析 法,离 子 交 换 层 析 的 操 作,离子交换剂预处理和装柱 加样与洗脱洗脱馏份的分析 离子交换剂的再生与保存,离子交换层析的应用,生物产物的主要分离纯化和分析手段，如氨基酸、多肽及蛋白质，核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子，如多糖等；还可用于水处理。,亲 和 层 析 法,是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。 具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。,亲 和 层 析 法 的 作 用 机 理,固相担体,(1),(2),(
3、3),A,B,Sample,Washing,Elution,亲 和 层 析 的 特 点 及 应 用,亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。 但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。 主要应用于生物大分子的分离纯化。,纸 层 析 法,纸层析的原理？ 纸层析的固定相和流动相分别是什么？滤纸的作用？ 比移值的概念是什么？ 纸层析法对滤纸的要求？根据Rf值如何选取滤纸 纸层析的操作步骤？ 点样应选取哪类溶剂，点样方法是什么？ 展开方式有哪几种？展开剂的选取原则？ 纸层析法的特点？,纸 层 析
4、法,纸层析法是以纸作为载体的层析法，分离原理属于分配层析的范畴。 原理：滤纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。,纸层析可以看做是溶质在固定相和流动相之间连续萃取的过程，根据溶质在两相间分配系数的不同而达到分离的目的。 样品经层析后，常用比移值Rf来表示各组分在层析谱中的位置,纸层析的操作,点样 展开 显色 分析,样品溶于适当的溶剂中，尽量避免用水； 一般用乙醇、丙酮、氯仿等，最好采用与展开剂极性相似的溶剂，液体样，直接点样。,点样,点样 先用铅
5、笔在距纸条一端2 3 cm处划一条直线（起始线）并在线上隔一定距离划一“x”号表示点样位置，见下示意图：,点 样,点样工具：微量注射器、毛细滴管(0.5 mm)； 点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与“x”号接触，使点样的斑点直径为0.2 0.5 cm, 每次点样2 20 l于滤纸上，以冷风吹干； 原点面积越小越好，每次点样后原点扩散直径以不超过23mm为宜； 干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。,展 开,展开剂由一种或多种溶剂按一定比例组成。 展开剂的选择： 待分离物在两相中的溶解度 展开剂的极性 展开剂与待分离物间应无化学反应 待分离物在展开剂中的分配系数最好不受温度的影响
6、 待分离物在两相间的分配平衡瞬间达到,展 开,常用展开剂：水饱和的正丁醇、正戊醇、酚、四氯化碳、氯仿、苯、丁酮、丙酮、有机酸、有机碱，有时也加入一定比例的无机酸、无机碱、甲醇、乙醇等。 展层方法：展层前，层析缸与已点样滤纸必须予先经水蒸汽、溶剂蒸气饱和。 展开方式：上行法、下行法、环行法、双向展开法。,上行法,将点有试样的滤纸条的下端浸入溶剂（但不能浸没点样处），上端固定在层析缸的上部，保持垂直，将缸密闭，使溶剂沿下端上升而展层。待溶液上升到距离纸上端3 4 cm 时，将滤纸取出，用铅笔在溶剂前沿处画线作记号。,玻片,玻璃棒,原点,玻皿,剪成锯齿状，便于溶剂滴下,下行法,溶剂自纸的上端向下降(
7、借助于重力的作用)，具有分离速度快及连续挥发色谱的优点。,取圆形滤纸在直径的两边各画两根平行线，用剪刀沿这两根线剪至圆心处，在纸的中央滴上试液。 是一种既快又方便的方法。,环行法,用一种溶剂不能将组分分开时，可试用该法。,若前后二次展开剂选择适当，可使各种组份完全分离。例如，氨基酸的分离可用此法。也可以二次使用同一种展开剂展层。,双向展开法,展层后，取出滤纸，用铅笔在溶剂前沿作记号。 有色物：直接观察各个色斑 无色物： 物理法显色：用紫外灯照。 化学法显色：喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。,显 色,定性：根据物质的Rf，为了查明未知物的组成，在同样条件下与已知的纯物质做对照实验。 定量 剪洗法
8、 比较法：制标准系列图谱，与待测斑点颜色、面积进行比较，确定其可能的含量。,分 析,纸 层 析 的 应 用,在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经常被使用； 用于无机离子的分离； 作为高效液相色谱的一种预试方法。,思 考 题,用纸色谱法分离A、B两种物质，在某条件下两物质的比移值分别为0.36、0.40。设A、B两物质斑点的直径分别为0.2 cm,0.4 cm,当展开剂的前沿达到10 cm时，A、B能否完全分离? 用纸色谱法分离A、B两种物质，在一定条件下A、B两物质的比移值分别为0.35,0.45，设A、B两物质色谱斑点的直径分别为0
9、.50cm和0.80cm,要求展开剂前沿至少达到多少厘米时，A和B才能完全分离?,第 一 题,设A、B两物质色谱斑点的中心距原点分别为 x1、x2cm，则x1/10 = 0.36 x2/10 = 0.40x2-x1 = (0.40-0.36)10 = 0.4(cm) 欲分离两物质，两斑点中心距离至少为(0.20+0.40)/2 = 0.30cm, 而实际两斑点中心距离为0.4 cm , 故在此条件下A B两物质可得到完全分离。,第 二 题,设x1, x2分别为AB两物质斑点距原点的距离： 则 x1/y=0.35 x2/y =0.45x2-x1=0.40+0.25=0.65 又 x2-x1=(0
10、.45-0.35)y =0.65 故 y =6.5(cm),薄 层 层 析 法,层析法中应用最普遍的方法之一； 它具有分离速度快、展开时间短、分离能力强、斑点集中的特点； 灵敏度高，通常几至几十微克的物质，即可被检出； 显色方便，可直接喷洒腐蚀性显色剂，如浓硫酸等，也可在高温下显色。,薄 层 层 析 的 操 作 方 法,薄层层析的一般操作程序：制板 点样 展开 显色 分析,点 样,展 开,薄层的展开需在用展开溶剂予先饱和的密闭器皿中进行，展开方式和纸层析相同。但不加粘合剂的薄板只能作近水平式（与平面成20 10角）而不能垂直展层。,显 色,有色溶液 ：直接将样品色斑与标准色斑移位的距离 作比较
11、 。 无色溶液 被紫外线激发显荧光的物质 ：直接在紫外灯下观察荧光斑点。不显荧光 ：在吸附剂中渗入少量荧光性物质。化学显色：喷雾法、薰蒸法。,喷 雾 法,薄 层 色 谱 的 定 性、定 量 方 法,定性分析：显色后，显出原点到斑点中心和原点到溶剂前沿的距离后，计算Rf值，然后与文献记载的Rf值比较以鉴定各种物质。 定量分析 直接在薄层板上测量斑点面积的大小或比较颜色的深浅，与标准品比较作为半定量。 洗脱定量法,分 离 方 法 的 选 择,气相色谱法 （Gas Chromatography GC）特点 分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快等。主要用于中药制剂中挥发油及其他挥发性组分，及水分
12、、乙醇、甲醇和农药残留量的测定。但本法对挥发性差或遇热易分解破坏的物质难以分析。分类1.按固定相状态分类：气固GC、气液GC2.按分离原理分类：吸附GC、分配GC3.按色谱柱分类：填充柱GC、毛细管柱GC 后者分辨率高（n10 ）常用于农残分析,仪器及其工作原理工作原理 加热分析样品使其气化，由载气带入色谱柱，由于各组分在固定相与载气间分配系数不同，经分离依次被载气带入检测器，将各组分的浓度或质量转换成电信号并记录成色谱图，根据峰高或峰面积进行定量分析。,N2,H2,空气,色谱柱,进样器,FID,记录仪,电流 放大器,气相色谱仪,气路系统、进样系统、分离系统、检测系统、温度控制系统、记录系统、
13、数据处理系统,组成部分：,2. 进样系统进样系统的作用是将液体或固体试样，在进入色谱柱之前瞬间气化，然后快速定量地转入到色谱柱中，进样的大小，进样时间的长短，试样的气化速度等都会影响色谱的分离效果和分析结果的准确性和重现性，包括： （1）进样器 （2）气化室：为了让样品在气化室中瞬间气化而不分解，因此要求气化室热容量大，无催化效应。,3. 分离系统分离系统由色谱柱组成。有填充柱和毛细管柱两类。 (1) 填充柱 由不锈钢或玻璃材料制成，内装固定相，一般内径为2 6mm，长0.5 6 m。填充柱的形状有U型和螺旋型二种。 (2) 毛细管柱 内径一般为0.1 0.5mm，长度20 300m，呈螺旋型
14、。,毛 细 管 柱,色谱动力学理论认为，气相色谱的填充柱在运行中存在严重的涡流扩散，影响柱效的提高。1957年Golay由它的理论发明开管柱，它是一根内径0.1-0.5mm，长度为 10-300m的毛细管柱，每米理论塔板数为2000-5000，总柱效最高可达106。可分析复杂有机混合物，如石油成分、天然产物、环境污染、生物样品。,毛细管柱与填充柱的比较,毛细管柱与填充柱色谱仪主要部件比较,4. 检测系统浓度型检测器 测量的是载气中组分浓度的瞬间变化，即检测器的响应值正比于组分的浓度，如热导检测器（TCD）、电子捕获检测器（ECD）。质量型检测器 测量的是载气中载气中组分的质量流速的变化，即检测
15、器的响应信号正比于单位时间内组分进入检测器的质量，如氢焰离子化检测器（FID）和火焰光度检测器（FPD）。,热导监测器TCD(Thermal Conductivity Detector),氢火焰离子化监测器FID(The Flame Ionization Detector),电子捕获检测器: ECD(Electron capture detector),火焰光度检测器: FPD(Flame photometric detector),高效液相色谱法(HPLC),高效液相色谱法概述 高效液相色谱仪的结构高效液相色谱法的主要类型有选择,现代液相色谱和经典液相色谱,HPLC是在经典色谱的基础上发展起
16、来的； 现代液相色谱将流动相改为高压输送，色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万），同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测； 高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点，故称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。,液相色谱与气相色谱的比较,相同点： 液相色谱所用基本概念保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致； 液相色谱所用基本理论塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。 不同点：,高 效 液 相 色 谱 仪,高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分
17、组成。,一、高压输液系统 由于HPLC所用固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备； 一般由贮液器、高压泵、梯度洗脱、脱气装置和压力表等组成； 贮液器要惰性、耐腐蚀，配有过滤器； 高压泵应密封性好、输出流量稳定、压力平稳； 梯度淋洗通过连续改变流动相极性、离子强度等使保留时间过短而峰形重叠，或过长峰形扁平宽大的组分，都获得良好的分离； 脱气采用氦气鼓泡驱除流动相中溶解的气体。,(1)流动相贮存器,流动相中气泡？,原因危害脱气,超声波振荡；惰性气体鼓泡吹扫脱气；真空脱气。,流速 不稳、基线 起伏、噪音峰 尖锐、检测器问题,氧气、空气,在线真空脱气和He脱气对保留时间再现性的
18、影响,(2)输液泵,基本要求 1 流速稳定 2 流量可调 3 耐高压 4 死体积小 5 耐腐蚀,(3)梯度淋洗装置,外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度:一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,二、进样装置 柱较短，能由进样系统、连接管道等存在的死体积引起柱外展宽，故进样技术要求高，有两种： 注射器进样 具有快速、简便、可任意改变进样体积等特点，但进样体积不宜过大，进样重复性欠佳，试样易渗漏； 六通阀进样 由阀芯、阀体、定量管组成，特点为进样量由选定的定量管而固定，重现性好。,2
19、 进样装置,耐高压的六通阀进样装置,三、分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件； 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成，其内径为2 6mm，柱长为10 50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相； 柱温一般为室温或接近室温。,3 高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,高效液相色谱法的主要类型,液固吸附色谱法液液分配色谱法化合键合色谱法离子色谱法分子排阻色谱法,四、检测器 检测器是HPLC的三大关键部件之一，但至今乃是一个薄弱环节；按适用性分两类： 通用型检测器 对大多数物质的响应差别不大，适用于所有物质的检测，如示差
20、折光检测器等； 选择性检测器 对不同组成的物质响应差别极大，只能选择性地检测某些物质，如紫外检测器、荧光检测器等。,液相色谱检测器,a. 紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高； 线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,b. 光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,c. 示差折光检测器 （differential refractive index detector）,除紫外检
21、测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；,酶联免疫分析法(ELISA),六十年代出现的新的免疫测定技术，当时主要用于临床诊断，如检测药物、蛋白和病毒，经过三十多年的不断改善和完善，已成为一种不可替代的普遍运用的分析法。该分析法在临床诊断上的巨大成功，引起许多食品分析家的兴趣，并于七十年代末将该方法用于食品卫生分析的研究和应用。,ELISA是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机的结合起来的一种检测技术。 其主要依据有三
22、点：抗原(抗体)能结合到固相载体的表面仍具有其免疫活性；抗体(抗原)与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性与酶的活性；相应的抗体(抗原)反应后结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体(抗原)的含量。,ELISA的基本原理,酶联免疫吸附试验原理,三种测定方法，即直接法、抗体夹心法和竞争法。前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法是测定小分子。,双抗体夹心法,ELISA的特点,灵敏度高 最低检出量可达pg级，并可定量测定，而薄层层析法最低检出量只有ng； 干扰小 强的特异性 测定步骤简便快速 干扰小，特异性强，简化了样品的预处理和纯化过程，同时操作步骤也非常
23、简便，测定时间因而就大大缩短。 操作安全，无污染 由于灵敏度高，标准品浓度就低，使操作者减少了接触高浓度有害物质的机率，同时减少了对环境的污染。,ELISA在食品卫生分析中的应用,真菌毒素 农药残留 环境污染物 ，如苯并(a)芘 毒素 ，动物毒素如河豚毒素，植物毒素如植物碱 微生物 ，如沙门氏菌，大肠杆菌O157的检测 食品添加剂,本 章 小 结,掌握食品检验的概念，了解食品检测技术在食品科学研究中的作用。 感官检验法一节中，要求掌握食品感官检验的有关概念和食品感官检验类型及特点，熟悉食品感官检验标准化的建立，了解食品感官检验的作用和影响因素。 化学分析法一节中，要求掌握定性分析的概念，定量分析的类型，了解各定量分析在食品检验中的应用。 物理化学分析法一节中，掌握层析法的基本原理及分类，掌握本章所讲的几种层析技术的分离原理。,本 章 小 结,物理化学分析法一节中，要求熟悉仪器分析的分类，熟悉吸附层析常用的吸附剂及洗脱剂，熟悉凝胶层析、离子交换层析、纸层析及薄层层析的操作、原理及适用对象，了解凝胶层析中使用的几个参数及常用的几种凝胶剂，离子交换层析中常用的交换剂。 酶联免疫吸附分析法 一节中，了解酶联免疫吸附分析法的基本原理、特点及应用。,
