1、马玉超 北京林业大学生物科学与技术学院 办公地点：生物楼117；电话：62336016； Email:,现代微生物学实验技术,实 验 内 容, 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 转座子随机突变及目的表型的筛选 大肠杆菌-半乳糖苷酶的诱导 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取,转座子随机突变及目的表型的筛选 李丽萍,实验目的,1.了解细菌常见转座子Tn5的结构及转座机理 2. 学习利用转座子进行随机插入突变的实验过程 3. 掌握双亲接合实验的原理及过程,实验原理,转座子： 转座因子或跳跃因子，它可以从遗传物质的一部分跳跃到另一部分，从而引起遗传变异。 转座
2、子的发现： 20世纪50年代初期，美国冷泉港实验室遗传育种学家McClintock 通过对玉米籽粒色斑不稳定现象的研究而发现转座现象，首次发现了能在基因组内不同区域转移的控制成分。,实验原理,细菌转座子的类型： 插入序列 (Insertion sequence); 复合转座子 (Composite transposons); Tn5 TnA 转座子家族 (TnA family); 可移动噬菌体 (Mu phage).,实验原理,Tn5：发现于E.coli，序列全长5818bp。 核心序列：编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素)；两个倒置的IS50：IS50R编码53KD的Tnp和48KD的
3、转座阻遏蛋白(Inh),两者使用同一阅读框，但启动子不同。IS50L的第1442碱基处存在一个赭石突变，IS50具有19bp的倒置末端，二者有7个碱基不相同，是转座酶(Tnp)的作用位点。,Tn5的转座机理,实验原理,实验原理,DNA sequencing,实验原理,非转移性质粒： 转移性质粒：能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能 带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移; 接合作用：质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接接触才能进行.,实验原理,植物生长激素， 由植物根系细菌合成，对植物的生长及一些发育阶段的调控起关键作用,细菌中IAA合成的几种途径,A-B：吲哚乙酰胺途径；
4、 E-F-D：吲哚丙酮酸途径； C-D：色氨酸侧链途径,实验材料,菌株E. coli S17-1/pPRL1063a; 巴西固氮螺菌sp7 2. 培养基及试剂 (1). 细菌丰富培养基,(2).用于IAA摇瓶培养的培养基(MAZ培养基),(3).抗生素,3. 主要仪器小型离心机,实验步骤,第一天： 中午12：3013：30接种sp7 至5ml LD 液体培养基中，30振荡培养约20小时。 晚5：30，接种供体菌pRL1063a/E.coil S17-1 至5ml LB+Km液体培养基中，37振荡培养约16小时。 第二天： 上午9：00，用同一个1.5 ml 离心管收集适量供体菌和受体菌。120
5、00rpm 离心30 sec，弃上清，用移液器将菌泥悬浮混匀后移入LD平板中央，尽量减少气泡的产生。 30正置培养过夜。注意：事先准备好LD平板,第三天： 用液体LD培养基洗下菌泥，铺于同时含有Km、Ap、Nx的LD平板上，30培养，筛选接合子。 第四天： 挑取接合子在含有上述三种抗生素的LD培养基平板上划线分离，保证得到的为单菌落。 第五天： 挑单菌落分别接种于5ml MAZ培养基中30摇瓶培养（野生菌对照）.,第六天： 用比色法测定菌液中的IAA含量。 比色试剂：含12g/L FeCl3 的H2SO4 注意安全 取1ml 测量OD600； 取1ml 菌液12000rpm 离心 5min后取上清与比色试剂等量混合，摇匀后在暗处放置30 min，然后测OD540nm 注：空白对照，未接菌的培养基与比色用试剂的混合液。,标准曲线,实验结果,表 巴西固氮螺菌 Yu62 野生型及突变体的IAA产量,下次实验,大肠杆菌-半乳糖苷酶的诱导,
