1、生物化学实验 Biochemical Experiment,实验成绩评分方法,实验预习情况（10%） 实验操作情况（30%） 实验报告情况（30%） 实验考试成绩（20%） 实验素质（遵守实验室规则和道德行为）（10%）,本学期实验课安排,有关网址和参考书目,http:/ http:/www.kumc.edu/biochemistry/bioc800/biocindx.htm http:/cti.itc.virginia.edu/cmg/ http:/www.bio- 赵永芳. 生物化学技术原理及应用.北京. 科学出版社.2002 沈同 王镜岩.生物化学.高等教育出版社.2002,、蛋白质的盐
2、析分离和凝胶层析脱盐,蛋白质的盐析分级分离 SephadexG-25脱盐 盐离子的跟踪检测 检测蛋白质,蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术,材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）破细胞（匀浆器，研钵，超声波，反复冻融，化学方法，酶解等）蛋白质提取（根据物质的性质，水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂）蛋白质分级分离（盐析分级分离、有机溶剂分级分离、等电点分离） 进一步纯化（透析、柱层析：分子筛、离子交换、亲和层析、HPLC）鉴定（电泳：薄层电泳（纸，NC膜）、凝胶电泳（PAG，琼脂，淀粉）；结构分析；活性分析；呈色反应）含量测定（fonlin酚法、考马斯亮蓝G250法）,蛋白质的分级分离（粗分级）,一
3、、盐析沉淀分离 1、盐溶和盐析现象：低盐浓度下蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而增加；盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而减小析出。 2、盐的选择：通常采用中性盐，硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。 3、硫酸铵浓度的计算与调整： （1）加硫酸铵饱和液：V=V0（S2S1）/（1S2）； （2）加固体硫酸铵：t=G（S2S1）/（1AS2） V为所加饱和硫酸铵体积； V0 为原溶液体积； S2 为需达到的硫酸铵饱和度； S1 为原溶液硫酸铵饱和度；G和A为常数，0 时G为507，A为0.27；20 时，G为533，A为0.27。t为每升加入的克数。,二、有机溶剂沉淀分离有机溶剂沉淀
4、出的蛋白质沉淀比盐析沉淀出的蛋白质沉淀易于过滤或离心分离，分辨率好，但容易使蛋白质变性，通常在低温下进行。 三、选择性沉淀法（等电点、热变性、酸碱变性等） 四、吸附法 五、重金属盐沉淀法,蛋白质的进一步纯化（细分级）,一、透析和超过滤二、层析（色谱）分离1、气相色谱（色谱仪）2、液相色谱：纸层析和薄层层析（分配层析）、柱层析（分子排阻、离子交换、亲和层析、吸附层析等）3、高效液相色谱（色谱仪）两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。,一些常用的蛋白质纯化中的仪器,机械细胞破碎仪,超声波细胞破碎仪,色谱工作站WINDOWS 98 作为色谱
5、分析的数据采集和处理，后端采用数据库工具 MS-SQL 在网络上进行分析结果的存档、检索及打印等。,高效液相色谱仪,气相色谱仪,蛋白质的盐析分离原理,用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白）易于析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。,凝胶层析原理,凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等 。对于某种型号的凝胶，一些大
6、分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。,凝胶层析载体,用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖等。使用最多的是交联
7、葡聚糖。交联葡聚糖的商品名为Sephadex,是由链状葡聚糖通过交联剂1氯代2，3环氧丙烷交联而成。交联剂添加越多，孔径越小，吸水量也越小；反之越大。以G-x表示型号，后面的数字可以看出交联度，数字越小，胶联度越大。SephadexG-25粗：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300m，筛孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子从内水体积流出。,实验步骤（一）卵球蛋白的沉淀,实验步骤（二）卵球蛋白的脱盐,注意事项实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。 样品溶液的浓度大一些好，但粘度不宜大，加样体积通常为凝胶柱床体积的1%-10%。 洗脱用的液体与凝胶溶涨和凝胶平衡时所用的一样。洗脱速度要恒定。 凝胶暂时不用时，要加防腐剂（如0.02%叠氮化钠溶液）再次使用凝胶时可再生后使用,蛋白质洗脱曲线记录方式,盐离子检测方法,用醋酸钡检测溶液中的硫酸根离子。 灵敏度高，与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀。同时不能同蛋白质形成沉淀。 实验中要设对照，即加入双蒸水和醋酸钡检测溶液。 为什么不用氯化钡？因为氯化钡易同蛋白质形成沉淀。 记录结果：,思 考,蛋白质的沉淀作用还有哪些方法？哪些是变性了？哪些没有变性？在分离蛋白质时常使用哪些方法？ 目前常用的脱盐还有哪几种方法？ 柱层析有哪些种类？其分离物质的基本原理？,
