1、实验四、质粒DNA的转化,一 实验目的,二 实验原理,三 材料仪器,四 实验步骤,五 实验结果图,六 结果讨论,七 思考题,一、实验目的,学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。,转化（transformation）:把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。 当受体菌处于感受态时，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。在培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，载体中抗抗生素基因得到表达，在选择性培养基平
2、板上，可选出所需的转化子（transformant）。,二、实验原理,三、材料仪器,实验仪器超净工作台、恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、涂布棒，微量取样器，冰盒等。,实验材料 大肠杆菌DH5感受态细胞； 质粒DNA:pCR4ToPoGt5GT7(Kan+Amp抗性)； LB固体培养基； 含Kan+Amp的LB固体培养基：将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60左右，加入Amp和Kan储存液，使终浓度分别为50g/ml，摇匀后铺板。,1从冰箱中取出感受态细胞，放置冰上； 2每组分别取2管20l感受态细胞悬液；第一管为转化实验组：1l重组质粒DNA+20l感受态细胞；第二管为阴性对照
3、组；加入1l无菌水+20l感受态细胞悬液；轻轻摇匀，冰上放置30分钟； 3将管放入42 恒温水浴中90秒，迅速将eppendorf管移到冰浴上，冷却2 min；,四、实验步骤,4.向上述eppendorf管中加入200uL LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37振荡培养20min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗性基因； 5.将上述菌液摇匀后取100l 涂布于含Kan+Amp的筛选平板上，涂布之后，在37培养箱中正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37培养12-16小时； 6. 涂布细则如下表：,涂布棒的使用,1、使用前，浸入75%酒精中； 2、在酒精灯上引燃涂
4、布棒上的酒精（不要烧到手）； 3、等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却； 4、涂布均匀； 5、将涂布棒重新除菌以备下一次使用； 6、阴性对照与重组DNA的涂布棒区别使用，避免DNA污染。,A(对照-Amp+Kan):100ul菌液涂布于LB+Amp+Kan培养基，菌落生长情况; B(转化-Amp+Kan):100ul菌液涂布于LB+Amp+Kan培养基，菌落生长情况; C(对照-无):100ul菌液涂布于LB培养基，菌落生长情况;,五、实验结果图,六、结果讨论,转化过程中的影响因素1受体细胞的生长状态和密度细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌
5、，可通过测定培养液的A600控制。,2质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但外源DNA的量过多时，则会使转化率下降。一般来讲，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的超螺旋DNA即可使50 l的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍。,3试剂的质量化合物及无机离子的影响：所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，分装保存于4。在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高。 4防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。 5整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。,七、思 考 题,1、制备感受态细胞的关键是什么？ 2、如果DNA转化后，没有得到转化子或者转化子很少，分析原因。 3、如何提高转化效率？,Thank you!,
