1、1.2 基因工程的基本操作程序,1.目的基因的获取,2.基因表达载体的构建,3.将目的基因导入受体细胞,4.目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中获取目的基因,1. 基因组文库,将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。,受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。,2. 部分基因文库,受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。,基因文库的构建模式图,通过对 受体菌 的培养而 储存基因,DUCK179制作,3. 基因文库的构建,（1）
2、基因组文库的构建,提取某生物 全部DNA,用适当 限制酶切割,许 多 DNA片段,与载体连接 导入受体菌群,该生物基 因组文库,（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）,（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成,mRNA,反转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA,与载体连接 导入受体菌群,该生物 cDNA文库,（二）利用PCR技术扩增目的基因,1. 原理,PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）,它是利用DNA 双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩
3、增技术。,2.条件,已知基因的核苷酸序列、4种脱氧核苷酸、一对引物、Taq酶 （及缓冲溶液）,3. 过程,高温变性（9095）,低温退火（5560）,中温延伸（7075）,双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。,多次重复,4.特点：指数形式扩增,利用PCR技术扩增,（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因,DNA合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN 核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,推测,推测,合成,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。,二、基因表达载体的构建,用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切
4、口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子，即基因表达载体。,用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口； 用同种限制酶切断目的基因，产生相同的黏性末端； 将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使两者结合成重组质粒。,以质粒为载体，将目的基因与质粒结合的步骤：,（一）构建目的,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。,（二）构建零件及其作用,1. 目的基因,2. 启动子 RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才
5、能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。,3. 终止子 一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。,4. 标记基因 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,三、将目的基因导入受体细胞,将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。,基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。导入受体细胞的方法 主要 是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。,1.农杆菌转化法,（一）导入植物细胞,2.其他方法（见教材P12“生物技术资料卡”）,（1）基因枪法 （2）花粉管通道法
6、,（二）导入动物细胞,显微注射技术,含目的基因的表达载体,动 物 的 受 精 卵,含目的基因的受精卵,早 期 胚 胎,雌性动物输卵管或子宫,转基因 动 物,显微 注射,分裂 分化,移 植,发 育,问题,为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？,（三）导入微生物细胞,2. 优点繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作简单、价格低廉。,3. 常用受体细胞大肠杆菌（E.coli）,1. 过程,（1）制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细菌易于接受外源DNA分子。,（2）重组DNA分子与感受态细胞混合，在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。,Ca2+ 处
7、理法,四、目的基因的检测与鉴定,目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。,常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。,（一）分子水平,1. 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,提取受体生 物全部DNA,适当限制 酶切割,DNA片段,用同位素标记的 目的基因片段杂交,显 出 杂交带,（表明目的基因已插入）,分子杂交技术,2. 检测目的基因是否转录出了mRNA,提取受体生 物的mRNA,用同位素标记的 目的基因片段杂交,显 出 杂交带,（表明目的基因已转录出了mRNA）,检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。,3. 检测目的基因是否翻译出蛋白质,抗原抗体杂交技术,提取受体生 物的蛋白质,与相应抗体杂交,显 出 杂交带,（表明目的基因已形成蛋白质产品）,（二）个体水平,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,
