1、细胞增殖检测方法细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。目前细胞增殖检测主要分为五类：DNA 合成检测、代谢活性检测、细胞数量检测、细胞增殖相关抗原检测和 ATP 浓度检测。在这些方法中作何选择，主要取决于所研究的细胞类型和研究方案。1. DNA 合成检测这是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。该法是将放射性标记的 3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的 DNA 中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。该方法耗时长，而且有个明显的弊端就，即使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。不过，可以使用 5-溴-2-脱氧尿苷BrdU 来进行类似实验，因为 Brd
2、U 也同样可以掺入到新合成的 DNA 中。但这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性 BrdU 单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。该方法的优点就是不再需要放射性物质。BrdU 标记很适合免疫组化 IHC、免疫细胞化学 IC、细胞内 ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。2. 代谢活性检测检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或 Alamar Blue 在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡
3、量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS 和 WST1。MTT 在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在 DMSO 或者异丙醇中。因此，MTT 主要作为终点检测方法。其他三种盐与 Alamar Blue 一样，都是可溶且无毒。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中 XTT的效率较低，需要添加额外的因子；WST1 更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色；Alamar Blue 的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有 100 个细胞就能够检测到。四唑盐和 Alamar Blue 氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方
4、便。它们适用的检测仪器包括：标准分光光度计、荧光分光光度计和酶标仪等。3. 活细胞数量最直接的增殖指标是活细胞数量的变化。但细胞直接计数法操作繁琐费时，所需细胞量较多，不推荐使用。4. 增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增殖细胞缺乏这些抗原，因此可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。例如，在人体细胞中，Ki-67 抗体识别同名蛋白，在细胞周期 S 期、G2 期和 M 期（增殖期）表达，而在 G0 期和 G1期(非增殖期 )不表达。用针对 Ki-67 蛋白的单抗就可以检测细胞的增殖情况。由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受肿瘤研究者们的青睐，因为它能够用来
5、检测体内肿瘤细胞的增殖。其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括：增殖细胞核抗原 PCNA、拓扑异构酶 IIB，以及磷酸化组蛋白 H3 等。5. ATP 检测细胞内的 ATP 含量受到了严格调控，检测 ATP 也可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含 ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的 ATP 浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶 luciferase 及其底物荧光素 luciferin 的 ATP 检测以生物发光为基础，能够提供非常灵敏的结果。如果有 ATP 存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与 ATP 浓度成正比，用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可
6、以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。选择策略怎样选择最适合的检测方法，主要依赖于使用的细胞类型和具体研究方案，还取决于实验者在细胞增殖中期望得到的信息。假如希望了解细胞增殖中的代谢活性变化，可以使用四唑盐和比色法检测；如果关注重点在于对 DNA 合成的改变，可以选择用 BrdU 或 EdU 标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析；若研究的是单个细胞，也可以用 BrdU 或 EdU 标记来检测 DNA 合成，将其与荧光标记的相应抗体结合，就可以通过流式细胞仪来进行流式分选。应该注意，测定细胞增殖很多时候单一方法都是有缺陷的，四唑盐MTT法不够精确；最直接的指标是
7、活细胞数量的变化，结果比较准确，但细胞直接计数法所需细胞量较多，操作繁琐费时；而 3H 掺入法麻烦且不安全。所以，建议最好用两种以上的方法进行测定，这样做主要是可以有一个用于辅助修正的数据。EdU 实验流程一、实验原理EdU（ 5-Ethynyl-2- deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的 DNA 分子中，通过基于 EdU与 Apollo 荧光染料的特异性反应快速检测细胞 DNA 复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA 修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行 siRNA、miRNA、小分子化合物及
8、其他药物的筛选实验。二、材料及准备工作试剂、耗材名称 品牌 货号Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro Imaging Kit(500T)广州锐博 C10327-1细胞培养板或培养皿试剂盒需 4C 储存，荧光试剂请避光，勿冻存，可稳定储存一年溶液配制1. PBS (pH 7.27.6) PBS缓冲液 10x NaCl 80 gKCl 2 gNa2HPO412H2O 36.151 g(Or Na2HPO4 14.4 gK2HPO4 2.4 g蒸馏水至 1000 mL 调 pH 值至 7.42. 渗透剂(含 0.5% Triton X-100 的 PBS) 3. 甘氨酸
9、溶液(2 mg/mL)（去离子水配配制，现用现配） 4. 细胞固定液(即含 4%多聚甲醛的 PBS) 多聚甲醛 4 g1x PBS 定容至 100ml，磁力搅拌器加热搅拌， 温度控制在 60以下。如仍不溶，滴加 NaOH (1N 或 0.1N） ，调 PH 值至 7.4。5. 1% BSA 的 PBS6. 甲醇7. 无水乙醇三、操作步骤及注意事项A 流式检测1. 样本制备1.1 取对数生长期的细胞，10 5 细胞接种于 6 孔板或培养皿中，培养箱中培养过夜； 1.2 可以根据实验需要进行各种药物处理。2. EdU 标记 2.1 用细胞培养液以 1:1000 的比例稀释 EdU 溶液 (试剂 A
10、)，制备适量 50 M EdU 培养基； 2.2 每孔加入 500 L 50M EdU 培养基孵育 2h。 （此步务必在超净台内完成）3. 细胞固定 3.1 用 0.25胰酶进行消化，转至离心管，用 1PBS 吸打后，1000rpm5min，弃上清；3.2 用含 1%BSA 的 PBS 吸打后，1000rpm5min，弃上清； 3.3 4%多聚甲醛的 PBS 固定 15min，1000rpm5min，弃上清； 3.4 用含 1%BSA 的 PBS 吸打后，1000rpm5min，弃上清； 3.5 300 L PBS 吹散细胞，加入 700 L 无水乙醇(制成 70%乙醇 PBS 液)，边加边震
11、荡混匀，4固定 24h 以上； 3.6 1000rpm5min，弃上清。 4EdU 反应 4.1 按下列顺序配置适量 1 Apollo反应液（现用现配，30 分钟用完，以免破坏正常的反应体系）： 4.2 加入 500 L 的 1Apollo染色反应液，重悬细胞，避光室温孵育 30 min，1000rpm5 min； 4.3 加入 500 L 0.5% TritonX-100 的 PBS 吸打，1000rpm5min ，重复 2 次； 4.4 每孔每次加入 100 L 甲醇冲洗 1 次，每次 5min；PBS 100L 脱色摇床5min。5. 染色 5.1 用去离子水按 100:1 稀释试剂 F
12、，制备适量 1Hoechst33342 反应液，避光保存； 5.2 弃上清，加入 500 L 1 Hoechst 33342 反应液，避光室温孵育30min，1000rpm5min； 5.3 加入 500 L PBS 吸打， 1000rpm5min，重复 2 次，洗脱 Hoechst 33342 反应液。 6流式分析 6.1 1000rpm5min 收集细胞， 300 L PBS 吹散细胞，自备 300 目尼龙滤膜过滤（若吹打成单细胞悬液，可不过网） ；转至流式管进行流式细胞仪分析，荧光通道依据实验仪器而设定。B 荧光显微镜检测1. 样本制备1.1 取对数生长期的细胞，410 31105 细胞
13、接种于 96 孔板中（细胞接种密度，没有严格要求，只要不影响显微镜下观察即可） ，培养箱中培养过夜； 1.2 可以根据实验需要进行各种药物处理。2. EdU 标记细胞 2.1 用细胞培养液以 1:1000 的比例稀释 EdU 溶液（试剂 A） ，制备适量 50M EdU 培养基； 2.2 每孔加入 100 L 50M EdU 培养基孵育 2h。 （此步务必在超净台内完成）;2.3 弃培养液，100 L PBS 清洗细胞 2 次，脱色摇床上，每次 5min。3. 细胞固定化 3.1 每孔加入 100 L 4% 多聚甲醛的 PBS，室温脱色摇床孵育 30 min；3.2 2 mg/mL 甘氨酸脱色
14、摇床孵育 5 min；（可在多聚甲醛固定时配置，现用现配。目的：中和多聚甲醛） 3.3 每孔加入 100 L PBS 脱色摇床孵育每次 5 min； 3.4 每孔加入 100 L 0.5% TritonX-100 的 PBS，脱色摇床孵育 10 min； 3.5 每孔加入 100 L PBS 脱色摇床孵育 1 次，10 min。 4EdU 反应 4.1 按下列顺序配置适量 1Apollo反应液（现用现配，30 分钟用完，以免破坏正常的反应体系）： 4.2 每孔加入 100 L 的 1Apollo染色反应液，避光，室温脱色摇床孵育 30 min； 4.3 每孔每次加入 100 L 渗透剂（0.5
15、% TritonX-100 的 PBS）脱色摇床孵育 2次，每次 10min； 4.4 每孔每次加入 100 L 甲醇冲洗 1 次，每次 5min；PBS 100 L 脱色摇床5min。5. 染色 5.1 用去离子水按 100：1 稀释试剂 F，制备适量 1Hoechst33342 反应液，避光保存； 5.2 每孔加入 100 L 1Hoechst 33342 反应液，避光，室温脱色摇床孵育 30 min； 5.3 每孔每次加入 100 L PBS 脱色摇床孵育 2 次，每次 5min，洗脱 Hoechst 33342 反应液。 6图像获取及分析 6.1 建议染色完成后，立即进行观测，因易淬灭
16、，曝光时间建议30ms；如果条件限制，请避光 4湿润保存待测，但不要超过 3 天。特别注意1、 Apollo 染色反应液一定要现用现配，按顺序加样 ，小心称量试剂 E，注意避光。试剂 E 易氧化，用毕请立即盖紧瓶盖。若发现试剂 E 粉末变黄，极可能是发生了氧化失效。2、 EdU 的使用浓度，用 50M 的较多，可以在 10-50M 间选择合适条件。3、 EdU 荧光极易淬灭，请染色后立即送检或镜下观察。附：EdU 与 BrdU 实验步骤比较EdU（ 5-Ethynyl-2-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的 DNA 分子中，通
17、过基于 EdU与 Apollo 荧光染料的特异性反应快速统计处于 S 期的细胞百分数来检测细胞DNA 复制活性。适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、 DNA 修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行 siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。1. EdU 的荧光染料是小分子物质(0.610 3 )，相对于 BrdU 抗体这样的大分子物质(15010 3)来说能够轻松地透过膜结构，这种能够有效快速地扩散和穿透组织的能力使得大的组织和器官碎片标本的快速处理成为可能。2. 这种小分子化学反应检测方法反应快，效率高，反应时间仅需几分钟，相比 BrdU 检测需要抗原抗体过
18、夜孵育， EdU 检测只需要 2.5 个小时。3. EdU 在检测掺入 DNA 分子中的乙炔基与小分子荧光叠氮化合物反应时不需要进行 DNA 变性处理（酸解、热解、酶解等），有效保证了 DNA 双链结构的完整性,避免样品损伤。不会像 BrdU 标记检测那样影响细胞核的复染，也不会破坏细胞的形态学特征以及细胞核抗原的识别位点。因此，EdU 检测技术就可以与包括细胞周期分析在内的其他 DNA 染色相结合，并且很好地相容。这种简单化的处理方式同样有助于在组织器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，使其具有更高的敏感度和更快的检测速度。4. EdU 标记可以通过结合其他抗体标记等技术，对细胞表面或细胞
19、内特异性标志物进行多重检测和多参数分析，在细胞水平进行系统性定量检测，直接获取细胞多维信息，深入开展细胞增殖、细胞周期、细胞毒性、DNA 复制及修复、信号通路等方面的研究。5. 不同于 BrdU 标记检测技术那样依赖于抗原抗体的结合，EdU 检测中形成的这种特殊的生物合成物(稳定的三唑环) 无需抗原抗体反应，有效地降低了背景的干扰，并显著提高了检测的灵敏度。6. BrdU 需要 DNA 变性后才能与抗体结合，导致 BrdU、Hoechst 染色弥散，边缘模糊不清；而 EdU 边缘清晰完整，检测更灵敏、更准确；Apollo 染料分子很小，能够轻松地透过膜结构，无需 DNA 变性即可与 EdU 特
20、异结合发光，而且不会影响其与其它染料的结合，能够准确进行 DNA 定量。EU 是尿嘧啶的类似物，同样通过“click”化学反应能够标记上荧光。所不同的是 EU 是在细胞转录合成 RNA 的时候掺入到 RNA 里面。所以用这个技术能够 染出目标细胞新合成的 RNA，从而达到检测细胞活性、毒性、RNA 转录定位、RNA 分布检测及 RNA 与蛋白的相互作用（此项需结合免疫荧光技术使用）等研究的目的，同样有高精度、高灵敏度、操作简单方便等诸多优点。EU是研究细胞活性、毒性及 RNA 转录情况和机制等的理想工具。 MTS 检测细胞增殖实验一、 实验原理本试剂盒是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒实验中
21、的活细胞数量的检测试剂。此试剂含有一个新型的四唑化合物3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphe nyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS(a)和一种电子偶联剂(phenazine ethosulfate ; PES)。PES 具有增强的化学稳定性，这使它可与 MTS 混合形成稳定的溶液。 MTS (Owens reagent) 被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物，可直接溶解于培养基中（图 1） 。这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的 NADPH 或 N
22、ADH 的作用下完成的。检测时，将少量的 CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent 直接加入培养板孔的培养基中，孵育 14 小时，在 490nm 处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比。 二、 材料及准备工作试剂、耗材名称 品牌 货号CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation AssayPromega G3581(5000T)96 孔细胞培养板特别注意1. 20C 避光长期储存；频繁使用时 4C 避光保存 6 周。注意：实验证明此试剂冻融 10 次后与新鲜的试剂使用效果相同；2. 此
23、物质的化学、物理和毒理学性质还未完全研究清楚，因此建议在使用此试剂时带手套，穿实验服并带护目镜；3. CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 是光敏感试剂，装在琥珀色的容器中。试剂暴露在光线下数小时后可能会发生褪色。这种褪色反应可能会导致 490nm 的背景吸光值轻微升高，但不会影响检测结果。实验准备1. 多道加样器（排枪） ，或连续式加样器；2. 酶标仪。三、操作步骤及注意事项1. 样本制备1取对数生长期的细胞，以 5103 细胞接种于 96 孔板中作为增殖研究的起始细胞数。或根据实验细胞的增殖曲线选择合适的接种密
24、度；由于最外缘培养孔中培养基的挥发较强，尽量避免在其中种入细胞，并且最好能够在其中加入一定量培养基保证中间孔不会产生过度挥发。2可以根据实验需要进行各种药物处理。2. 试剂准备2.1 室温静止 90 分钟或 37C 水浴 10min，使 CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent 融化。3. 反应及检测3.1 在 96 孔板中，每孔 100ul 培养基加 20l CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent；推荐以排枪或连续式加样器及数字式加样器加试剂，以保证加样方便准确3.2 在 37C，5% CO 2 的环境下孵
25、育 1-4h，通常 2h 为；如果立刻检测就直接进行后续步骤，如果需要以后检测，每孔加入 25 l 10% SDS 终止反应，避光保存于室温的湿盒中，最多可保存 18h，然后再继续。3.3 酶标仪 490nm 读取吸光度值。特别注意1. 读取波长选择：图 2 显示 MTS 还原后产生的甲臜产物的吸光度光谱。推荐在吸收峰 490nm 读取数据。如果酶标仪没有 490nm 的滤片,可以在450540nm 范围内读取数据。如果需要，可以在其它波长读取吸光度值，但检测灵敏度会降低。在 630700nm 范围的参考波长可以用来减去细胞碎片过多造成的背景值，以及其它非特异性吸光度值。2. 490nm 的背
26、景吸光度值校正: 在以 MTS 试剂孵育后，细胞培养基中会在490nm 有微量的自发产生的吸收光。使用的细胞培养基种类，血清种类，pH 和暴露在光线下的时间长度都可能会影响 490nm 的背景吸光度值。孵育4h 后，背景吸光度值通常在 0.20.3。背景吸光度可能受某些带四唑还原反应的化合物的影响。强还原物质，包括维生素 C,或含巯基的化合物, 如谷胱甘肽，辅酶 A 和二硫苏糖醇, 能够以非酶的方式还原四唑盐，从而导致背景吸光值的增加。高 pH 的培养基或长时间暴露在直接光照下面也可能导致自发的四唑盐还原反应的加速进而导致背景吸光值的增加。如果使用含酚红的培养基，快速的颜色变化可能指示待测化合
27、物引起的 pH 值变化。待测化合物产生的特异的化学干扰可以通过检测对照孔（含有不同浓度待测化合物的培养基，但是不含细胞）的吸光度来确定。490nm 的背景吸光度值可用下述方法校正：准备 3 个重复的无细胞对照孔，含有与实验孔同样体积的细胞培养基和 CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent。从所有其它孔的吸光值中减去“无细胞”对照孔在 490nm 的吸光度平均值，即可得到校正的吸光度值。图 2. MTS 四唑化合物还原后产生的甲臜产物的吸光度光谱在490nm 显示最大吸光值。负吸光值（382nm ）对应的是 MTS 的消失（转化成甲臜产物） 。3. 细胞
28、增殖实验至少设 3 个复孔，连续监测 5-7 天。以细胞贴壁后记为时间 0点进行检测第一次检测，而后每 24h 进行一次检测，孵育时间保持一致。4. 淋巴细胞检测：淋巴细胞产生的甲臜比其它类型的细胞要少，为了得到更显著的吸光度值变化，需增加细胞数至约 2.510 104 细胞/ 孔，并在加入MTS 试剂后孵育培养板至最长的 4 小时。5. 试剂优化：如果使用不同体积的培养基,可以根据 20l 试剂/100l 培养基的比例调整。这个试剂:培养基比值产生的 MTS 终浓度为 317g/ml /实验孔。对于不同的细胞系，最适的四唑盐和电子偶联剂的浓度可能会有微小的变化，但检测灵敏度很少受到影响。6.
29、 细胞数优化：不同类型的细胞，代谢活性不同。影响细胞代谢的因素也会影响细胞数和吸光值的关系。黏附依赖性细胞在高细胞密度时会产生接触抑制，进而代谢活性降低，导致细胞数和吸光度值的非线性关系。影响细胞质体积或细胞生理状态的因素也会影响代谢活性。对大多数肿瘤细胞，杂瘤细胞和纤维母细胞系，推荐 5,000 cells/孔作为增殖研究的起始细胞数 ，虽然少于 1,000 个细胞通常也可被检测。血淋巴细胞例外，一般需要25,000250,000 细胞/孔才能获得足够的吸光度值。四、结果判定附：代谢活性检测3H-胸腺嘧啶核苷掺入法(3H-TdR)胸腺嘧啶核苷(TdR) 是 DNA 合成的前体物，处于 S 期
30、的细胞不断摄取 TdR用以合成 DNA。3H-TdR 掺入法是将被放射性标记的 3H-TdR 掺入处于 DNA 合成期的细胞内，3H-TdR 掺入量的多少可客观反映细胞复制 DNA 能力的大小从而间接了解细胞增殖情况，用液体闪烁计数仪检测出 3H 放射活性即可反映DNA 含量。优点：该法对各种动物肿瘤及人类肿瘤均有较好的预测价值和重复性。缺点：操作复杂，试剂含有放射性同位素，对实验者有一定的危害，限制了其应用。四甲基偶氮唑盐法(MTT)MTT 商品名为噻唑蓝，是一种黄色的染料，其原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶 -甲瓒(formazan)，并沉
31、积在细胞中，而死亡的细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值可间接反映活细胞数量，在一定细胞数量范围内 MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。优点：简便灵敏且无放射性。缺点：MTT 溶液需要放置在 4，避光保存，最好是现用现配；由于 MTT经还原所产生的产物甲瓒不溶于水无法直接测定吸光度需要被溶解之后才能检测，这不仅使工作量增加，而且 MTT 溶液具有致癌性； MTT 法只能用来检测细胞相对数和相对活力，不能测定细胞的绝对数；过氧化物会降低 MTT 测定的准确度，抑制将近 95%的 MTT 与 O2-的反应；MTT 溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上而致
32、使检测的结果呈现假阴性。二甲氧唑黄比色法(XTT)XTT 是一种与 MTT 类似的四唑氮衍生物，可被活细胞还原形成水溶性的桔黄色的甲瓒产物，不形成颗粒，可直接用酶联免疫分析仪检测吸光度从而检测细胞增殖及活性。加上电子偶合剂如硫酸酚嗪甲脂(PMS)后可大大提高 XTT的检测效率。优点：XTT 比色法 XTT 法省去了溶解还原产物结晶的步骤，故较 MTT 法更加快速简便敏感。缺点：XTT 水溶液不稳定，需要低温保存，现配现用；由于 XTT 的代谢产物呈桔黄色，故培养体系中有些黄色代谢物和试剂可能会影响其检测结果；与 MTT 一样，过氧化物可抑制近 95%的 XTT 与 O2-的反应，故对 XTT
33、测定的准确度有一定的影响。内盐法(MTS)MTS 是一种新型的 MTT 类似物，在偶联剂 PMS 存在的条件下可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物，其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关，可用酶标仪检测。优点：无放射性，快速安全，方便灵活，特异性强，克服了 MTT、XTT 的缺点，比 MTT 法更加准确。缺点：在 96 孔板试验中，最外侧的一圈孔内液体易蒸发，对检测结果有一定影响；不适合于淋巴细胞促有丝分裂反应的检测。四唑单钠盐法(WST-1)WST-1 是一种类似于 MTT 的水溶性四唑盐，在电子耦合试剂 PMS 存在时可被线粒体内脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒产物，细
34、胞增殖越多越快则颜色越深。优点：WST-1 是 MTT 的一种升级替代产品，其产生的甲瓒和 XTT、MTS相同均为水溶性，无需后续的溶解步骤，但 WST-1 比 XTT 和 MTS 更加稳定，且 WST-1 产生的甲瓒比 XTT 和 MTS 产生的甲瓒更易溶解，因此实验结果更加稳定灵敏度更高；测 WST-1 对细胞无明显毒性，而且 WST-1 显色后可在不同时间反复用酶标仪读板使检测时间更加灵活便于找到最佳测定时间。Cell Counting Kit- 8(CCK- 8)CCK-8 试剂中含有 WST-8，这是近年新开发的一种较 WST-1 更新的水溶性四唑盐检测，原理与 WST-1 类似。优
35、点：较 WST-1 更稳定，灵敏度更高，溶解性更强，更易于保存；CCK-8检测细胞增殖细胞毒性实验的灵敏度比 MTT、XTT 及 MTS 更高，数据可靠，重复性好，操作简便且无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞几乎没有毒性，尤其适合于悬浮细胞高通量药物筛选。小结3H-TdR 掺入法的放射性对试验者有一定的危害；MTT 法由于产生了不溶性的甲瓒检测步骤复杂且结果不准确；XTT 法虽克服了这个缺点，但其桔黄色的水溶性甲瓒产物亦影响结果的检测，且与 MTT 一样均受过氧化物的影响；MTS 法的检测原理类似 MTT 与 XTT，虽结果较二者准确，但检测结果易受外界环境影响，如试剂蒸发会影响其准确性；WS
36、T-1 是 MTT 的升级产品，其试剂和产物均属水溶性试剂本身稳定性更好产物的水溶性比 XTT 与 MTS 更高，因此结果更稳定、更准确、灵敏度更高；CCK-8 由于含有较 WST-1 更新的WST-8，细胞毒性低方法更简单灵敏度准确性和重复性更好尤其是被检测的细胞可重复利用利用价值更高。上述细胞增殖检测方法各具优缺点，因此在增殖检测中应避免使用单一方法 需结合实验目的及要求选择灵敏性特异性均较高的多种检测手段以便准确客观全面地反映实验结果。细胞平板克隆实验一、 实验原理细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖并形成克隆，而形
37、成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。二、 材料及准备工作1. 0.25%胰蛋白酶、10%胎牛血清的培养液、PBS。2. 结晶紫染液。3. 六孔板，细胞计数板等。三、 操作步骤及注意事项1 取对数生长期的各组细胞，分别用 0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，1000 rpm /min，离心后重悬于 10%胎牛血清的培养液中备用。2 将细胞悬液计数，计数后将细胞稀释到 1104/mL，按每组 100 L 细胞,分别接种于含 3 mL 37预温 10%胎牛血清培养液的六孔板中，并上下左右转动，使细胞分散均匀。置 37 5% CO2 及饱和湿
38、度的细胞培养箱中培养23 周。3 经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用 PBS 小心浸洗 2 次。加 4%多聚甲醛固定细胞 2mL 固定 15min。然后去固定液，加适量结晶紫染色液染 30 min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。4 将六孔板倒置拍照，用肉眼直接计数克隆，或在电脑作图软件计数中大于10 个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数） 100%5统计学分析：根据集落数和克隆形成率进行 t 检验，分析不同组别间的差异。平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散
39、得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。四、结果判定细胞软琼脂克隆实验一、 实验原理软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，但某些细胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用于此法。某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。二、 材料及准备工作15% 琼脂溶液：称取 5g 低熔点琼脂粉，溶于 100mL 生理盐水，高压灭菌备用。 20.25% 胰蛋白酶、含 10%胎牛血清的培养基。三、操作步骤及注意事项1. 取对数生长期的细胞，0.25%胰蛋白酶消化，离心收集
40、细胞沉淀。2. 完全培养基重悬，适当稀释后活细胞计数，调整细胞密度至 1103/mL。 3. 取 0.5mL 细胞悬液（即 500 个细胞） ，加入培养基，使体积达到 9.4 mL。37孵育。 4. 底层琼脂的制备：5%琼脂置于沸水浴中，使之完全融化，取出 1ml 移入无菌小烧杯中，待冷却到 50 度时，迅速加入 9mL 预温 37的完全培养基，混匀后立即取 0.8mL 浇注 24 孔板，室温凝固。 5. 上层琼脂的制备：步骤 3 中预温的 9.4mL 细胞悬液中加入 0.6mL50的 5%琼脂，迅速混匀，立即取 0.8mL 浇入 24 孔板，置室温凝固，每孔即含有 40个细胞，一般每个实验组
41、重复 3 个样本。 6. 常规培养 2-3 周。 7. 将培养板置于显微镜下计数克隆数，每个细胞集落含 50 个或大于 50 个细胞为 1 个克隆，计算克隆形成率，拍照。 集落数=n 孔中细胞集落数总和/n 克隆形成率=（集落数/接种细胞数）100% 8. 统计学分析：根据集落数和克隆形成率进行 t 检验，分析不同组别间的差异。特别注意1. 软琼脂克隆的操作相对复杂，在实验过程中一定要注意无菌操作。2. 将琼脂于培养基混匀时，要注意琼脂温度，而且动作要迅速，避免局部结块。3. 制备好底层琼脂后，要待其完全凝固后再浇制上层琼脂。四、结果判定对照组 实验组细胞计数法比较细胞增殖能力一、实验原理一般
42、细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后度过长短不一的潜伏期，进入大量分裂的指数生长期。在达到饱和密度后，细胞停止生长，进入平台期，然后退化衰老。典型的生长曲线即可分为潜伏期、指数生长期、平台期及退化衰老四个部分，其中的三个不同生长时相（潜伏期、指数生长期和平台期）是每个细胞系所共有的特征。通过测定生长曲线，不仅可以了解培养细胞生物学特性的基本参数、测定细胞绝对生长数、判断细胞活力，而且也可用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。本实验采用计数法测定细胞生长曲线，通过连续对细胞计数（通常为 7d，一般应每次计数 3 瓶细胞取平均值） ，然后以存活细胞数对培养时间作图，即得该种细胞的生长曲线。
43、二、材料及准备工作10.25% 胰蛋白酶、含血清的培养基。2. 倒置显微镜、血球计数板 、试管、吸管、移液管。三、操作步骤及注意事项1常规消化细胞、离心。2. 加入适量培养基重悬细胞，使之成为单细胞悬液。3. 按一定的倍数稀释细胞悬液。4. 用移液器吸取 10L 稀释后的细胞悬液，加样到血细胞计数板上。5. 10 倍镜下计数计数板四角大方格内细胞的数量。6. 按公式计算出细胞悬液的浓度，再根据原细胞悬液的体积计算出总细胞数。调整细胞浓度至 1105/mL。细胞浓度= 计数板四角大方格内细胞的数量/4稀释倍数10 4/mL。7. 24 孔板内每孔加入 900L 培养基，另外加入 100L 细胞悬
44、液（即 104 个细胞）。8. 按十字形晃动孔板，使细胞均匀分散，放入孵箱常规培养。9. 以后每 2 天换液 1 次。10. 从第二天开始，每隔 24h 取出孔板，随机选择 3 孔，吸弃培养液，加入 1ml胰酶消化细胞，然后加入 1ml 培养液中和胰酶的消化，制备单细胞悬液。11. 重复 4-6 操作，计算每孔总细胞数，取平均值。12. 以时间为横轴，细胞数为纵轴绘制细胞生长曲线。四、结果判定台盼蓝染色一、 实验原理台盼蓝（Trypan Blue）或称台盼兰、锥虫蓝，是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性。还常用于细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。 台盼蓝可被巨噬细
45、胞吞噬，故可用于巨噬细胞的活体染色剂。正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡，这与中性红作用相反。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。台盼蓝是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定染色方法之一。注意凋亡小体也有台盼蓝拒染现象。台盼蓝染色后，通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。台盼蓝染色只需 3-5 min 即可完成，并且操作非常简单。 二、材料及准备工作4%台盼蓝母液：称取 4g 台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4 度保存。使用时。用 PBS 稀释至 0.4%。 （也可买 Gibco的成品） 三、基本步骤 1胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。2染色：细胞悬液与 0.4%台盼蓝溶液以 9:1 混合混匀（终浓度为 0.04%） 。3计数：在 3min 内，分别计数活细胞和死细胞。 4镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。5. 统计细胞活力：活细胞率（ %）= 活细胞总数/（活细胞总数+ 死细胞总数）100%
