1、医学免疫学实验设计 期别：xxx 班级：xx 学号：xxxxxxxx 姓名：OOO IL-35 对小鼠 型糖尿病的治疗效果及免疫机制 【立题依据】 自身免疫性疾病（Autoimmune diseases）是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。如今越来越多的自身免疫性疾病被不断发现和认识，也越来越引起人们的关注。型糖尿病(T1DM 自身免疫性胰腺炎 )就是其中的一员，在全球大约有2000 万患者，中国至少有 100 万的患者，但是型糖尿病常常在幼儿和青少年时期发生且为一种多基因遗传病有较高的遗传度（75%） ，表现为明显的家族遗传性。同时，型糖尿病患者如治疗不善将引发严重
2、的并发症，如失明、肾衰竭、心脏病、截肢等。因此如果能正确了解型糖尿病的免疫学机制，并探索更加有效治疗及预防方案，对于患者本身乃至整个家族的身体和生活质量的提高意义重大。型糖尿病的免疫学发病机制是体内除了抗原提呈细胞（APC）和活化的 T 淋巴细胞外正常细胞几乎不表达 MHC-类分子，研究表明 IFN- 转基因小鼠的胰岛 细胞分泌IFN-，由于 IFN- 刺激 MHC-分子的表达这种小鼠的胰岛 细胞高表达 MHC-类分子，这样以来免疫细胞就会结合并识别胰岛 细胞然后对其进行攻击，使其丧失胰岛素分泌活性，最终导致体内胰岛素缺乏。调节性 T 细胞（Treg) 是一些 CD4+T cell 还可高表达
3、IL-2 受体的 链（CD25）分子，胞质中表达 Foxp3 转录因子的 T 细胞分化亚群。它的主要功能是通过抑制 CD4+ Tcell 和 CD8+ Tcell 的活化与增殖从而达到免疫的负调节作用。通过协调 Treg 水平来调节型糖尿病患者的免疫功能可能成为新的治疗手段。 白细胞介素-35（IL-35） 是 2007 年新发现的一种独特的具有免疫抑制功能的调节因子，属于 IL12 细胞因子家族，IL-35 为异源二聚，主要由活化的 Treg 分泌，对多种免疫细胞和细胞因子均有明显的抑制作用，参与介导机体免疫耐受的形成。IL-35 是否对型糖尿病患者具有治疗作用及其相关的免疫机制，还不十分清
4、楚，仍有待继续研究和解决。 【实验目的】 本实验就是通过提高 NOD 系小鼠（型糖尿病患鼠）体内的 IL-35 水平，观测小鼠各期的血糖尿糖等水平及后期的型糖尿病发病率、胰岛炎评分等，评定 IL-35 对型糖尿病的预防及治疗效果，并与其它一些免疫抑制性的药物（环孢菌素 A）等，进行药敏对比；同时，体外测定小鼠体内 IL-4 及干扰素- （IFN-）的等含量及调节性 T 淋巴细胞的含量等，对小鼠的免疫体质及 IL-35 对型糖尿病作用的免疫学机制有大体认识及方向把握，为以后的研究打下基础。从而为新药（联合药）的开发，免疫抑制领域的深入研究有一定意义。【实验对象】 NOD 系型糖尿病鼠和 NON
5、系正常不患病鼠 （雌性 4 周龄）起源 在对 ICR/Jcl 小鼠进行近郊培育的第 6 代，从白内障易感亚系分离出非肥胖糖尿病品系（NOD）和非肥胖正常品系（NON） 。在近交 20 代时，首先发现 NOD 雌鼠有胰岛素依赖性糖尿病。 特征 自发型糖尿病以及多种自身免疫疾病小鼠。通过病理学观察发现，NOD 小鼠自身免疫性胰岛炎发生于 4 周龄。NOD 小鼠发病后，充分呈现该品系小鼠糖尿病的生理生化特征即：尿频多饮高血糖症状。在几周的时间內，血糖迅速升高，饮水量剧增，大量的排尿，体重迅速下降，在这个过程中，患鼠血糖呈现迅速上升，后逐步下降，但仍维持高于正常值的状态，体重直线下降，最后昏迷而死亡。
6、于 12 周龄时出现明显糖尿病症状，至 30 周龄时雌性小鼠累计发病率可达到 80。 【实验材料】 试剂及仪器 IL-35 试剂，磷酸盐缓冲液(PBS), 酶联免疫吸附试验（ElISA）试剂盒，流式细胞仪，CD8 及 CD4 单克隆抗体，注射器等基础实验器械。 【实验方法及步骤】 1.小鼠的分组与处理 选取 NOD 系型糖尿病鼠 20 只和 NON 系正常不患病鼠 10 只，分为三组。10 只 NOD系小鼠作为实验组，10 只 NOD 系小鼠作为实验对照组，10 只 NON 系正常不患病鼠作为正常对照组。对各组四周龄小鼠采取：实验组注射 IL-35 注射液，每三天注射一次，注射量根据生物试剂公
7、司提供的 IL-35 试剂说明书为准，连续注射 7 周；实验对照组和正常对照组注射等量的磷酸盐缓冲液（PBS） ，注射方式同实验组。各组小鼠自由饮食，饮水不限。2.糖尿病及体重检测 从各组小鼠 10 周龄开始每周记录体重，每天采取断尾方式测血糖含量和尿糖含量，血糖连续 2 天超过 16.00mmol/L 即诊断为糖尿病，30 周后观察期满终止观察，计算各组小鼠发病率； 3.胰腺炎严重程度评分 30 周后，颈椎脱臼法处死各组小鼠，取各组小鼠胰岛做 HE 染色切片进行病理性胰岛炎评分：0 级：胰岛完整无淋巴细胞浸润，计 0 分；1 级：有胰岛周围淋巴细胞浸润（即胰岛周围炎）或50%的面积受累，计
8、3 分。记录各组小鼠评分值。4.细胞因子水平测定 取足等量的各组小鼠外周血用 ELISA 法检测 IL-4 及干扰素-（IFN- ）的含量； 5. CD4+CD25+调节性 T（Treg）细胞亚群测定 取各组小鼠脾脏制成单核细胞悬液，应用流式细胞法检测大鼠脾脏 CD4+CD25+调节性T（Treg）细胞水平。 7.统计学处理 应用 SPSS 统计学软件进行数据处理分析。 【预期结果及结论】 预期结果 实验组小鼠的发病率远低于对照组小鼠发病率；体重较对照组重；且对照组饮食饮水量远多于实验组和正常对照组；血糖和尿糖含量比对照组低，并接近于正常对照组（可偏高） ；干扰素-（IFN-）的含量实验组数据
9、远低于对照组和正常对照组鼠，IL-4 则恰恰相反；调节性 T（Treg）细胞实验组计数和活性较对照组和正常对照组高。 结果分析 IL-35 具有明显减少型糖尿病发生及减轻病情的作用；由于 IL-35 使 Th0 细胞向 Th2细胞分化，抑制 Th1 细胞分化，并升高调节性 T（Treg）细胞水平。所以 IL-35 可能通过上调机体 Treg，诱导 Th1 与 Th2 的平衡向 Th2 转化，从而不会减少免疫细胞对自体胰岛 细胞识别与破坏，保证了胰岛 细胞的正常胰岛素分泌功能，维持血糖的正常。为探索治疗型糖尿病的新方法提供理论依据。【实验可行性分析】 虽然没有用直接注射免疫抑制细胞因子来治疗自身
10、免疫病的相关报道，但本实验设计方案合理；分组、对照完备；体内和体外实验兼有；技术方法和路线可行。通过免疫学基础实验和理论的学习，已掌握免疫细胞、免疫分子的检测技术（ELISA 法） ，具有可操作性；实验所需药品、试剂及动物均较易获得，具备开展实验的条件。 【参考文献】 【1】 金伯泉医学免疫学 第五版北京：人民卫生出版社，2008 【2】 宋文刚免疫学实验教材北京：北京大学医学出版社，2010 【3】 孙黎飞细胞免疫学实验研究方法北京：人民军医出版社，2009 【4】 王培林，傅松滨医学遗传学第三版北京科学技术出版社 2011 【5】 哈佛医学院 Brigham and Womens 医院，e
11、Bioscience 公司的科学家Nature 罕见的抑制性因子美国2007 【6】 王嘉军微生物学免疫学新进展第 37 卷，第 4 期2011 【7】 周国庆，唐琴，黄丽，孙保亮泰山医学院学报，Treg 的免疫磁珠提取纯化方法【8】 姜小丽，杨婷 等中国免疫学杂志2013 年第四期哮喘小鼠中 Foxp3+Treg/Th17的失衡及意义 【9】 王建华糖尿病自我管理全书北京：北京科学出版社2010【关键词】 红细胞【摘要】 目的 应用红细胞免疫方法检测肿瘤患者红细胞免疫功能。方法 应用红细胞 C3b 受体花环试验和红细胞免疫复合物(Ic)花环试验，检测 114 例肿瘤患者的红细胞免疫功能。结果
12、 肿瘤患者红细胞 C3b 花环率显著降低(P 0.01)，红细胞免疫复合物花环率升高(P0.05)。乳腺癌术后红细胞 C3b 受体花环率升高，红细胞免疫复合物花环率降低。结论 肿瘤患者红细胞免疫粘附功能降低。【关键词】 红细胞；免疫； C3b 受体传统观念认为消灭体内突变细胞或肿瘤细胞是白细胞的功能，而对于红细胞在肿瘤发生发展中起何作用知之甚少。近年来随着对红细胞免疫功能的研究的逐步深入，有人发现癌症患者红细胞免疫粘附受体活性下降。为探讨恶性肿瘤与红细胞免疫粘附的关系，该研究对 114 例肿瘤患者进行了当前常采用的红细胞免疫功能二项指标检测，并与 50 例正常人进行对照。1 资料与方法1.1
13、一般资料 试验组：114 例均为临床病理确诊的肿瘤患者，其中肺癌 22 例，食管癌 30 例，脑肿瘤 10 例，鼻咽癌 8 例，肝癌 12 例，乳腺癌术后 12 例，其他肿瘤 20 例。对照组：正常人 50 例均为志愿献血者，男 40 例，女 10 例；年龄 20岁。1.2 方法 红细胞 C3b 受体花环(C3b 花环)试验，参照郭峰法。所用试剂均由上海长海医院提供。2 结果测定结果见表 1。乳腺癌术后患者红细胞 C3b 受体花环率低于对照组(P0.01)，其他各组红细胞 C3b 受体花环率明显低于正常对照组(P0.01)，而红细胞免疫复合物花环率除乳腺癌术后低于对照，其他各组均高于对照组，但
14、差异无显著性(P0.05)。表 1 两组二项指标检测结果比较 (略)3 讨论正常人体血液循环中免疫复合物少，因此红细胞 C3b 受体花环率高于红细胞 Ic 花环率，约为 2倍。文献报道，肿瘤患者红细胞 C3b 花环率显著低于正常人，而红细胞 Ic花环率高于正常人，提示肿瘤患者红细胞免疫粘附活性降低。本文测定 114 例肿瘤患者的红细胞 C3b 花环率显著低于正常人，与其他同仁的报道一致。引起肿瘤患者红细胞免疫失调的原因是：(1)肿瘤患者血清中存在一种免疫抑制因子，对其免疫功能有一定的抑制作用，可能起到破坏血清中促红细胞粘附肿瘤细胞因子的作用；(2)肿瘤患者体内大量形成的免疫复合物，参与对效应细胞的封闭，导致红细胞膜 C3b 受体空位减少，红细胞 C3b 受体活性下降，细胞免疫复合物增高。(3) 肿瘤患者单核- 巨噬细胞系统功能障碍而使 Ic 花环增多。从本文结果观察到乳腺癌手术后红细胞 C3b 花环率有所升高，红细胞 Ic 花环有所下降。因此动态观察肿瘤患者免疫粘附活性有可能对评价疗效、推测预后有一定的指导作用。
