1、实验十三 转化子的鉴定一原理 采用煮沸法快速提取阳性克隆质粒 DNA，对提取的 DNA电泳鉴定对与设计大小一致的质粒DNA进行目的 DNA片段 PCR扩增，对扩增产物进行电泳若扩增产物中出现特异条带，则可初步确定所得到的转化子力含目的基因的克隆。(一)煮沸法快速提取质粒 DNA1.取一张白纸，剪成培养皿大小，打上小格，每个小格标上号贴在盛 LB培养基的培养皿上。将散落在转化培养皿上白色菌落(蘸色菌落中载体质粒一般未插入片段)，分别接种到每一小格中，37培养过夜。2.用已灭菌的扁平牙签，按种编好号的白色苗落的细菌至相应编号的含氨苄青霉素的 LB液体培养基试管 5ml15ml 中，于 37剧烈振摇
2、下培养过夜。3.将 15ml 培养物倒人 15ml 微量离心管中，用微量离心机于 4以 12 000 rmin离心 30s，将剩余的培养物贮存于 4。4.吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。5.向含细菌沉淀的微量离心管中加入 350l STET，重悬菌体6.加 25l 新配制的 10mgml 溶菌酶溶液，振荡 3秒钟以混匀之7.将离心管放人煮沸的水浴巾，时间恰为 10s。8.用微量离心机于室温以 12 000 rrain 离心 10mm。9.用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。10.在上清液加入 40l 5molL 乙酸钠(pH5.2)和 420l 异丙醇，振荡混匀，于室温放置 5min。11
3、.用微量离心机以 15 000rmin 离心12.小心吸去上清液，将离心骨倒置于张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。4以 12 000r111111 离心振荡混匀，于室温放置15nun，回收核酸沉淀，13.加 lml70乙醇。以 15 000rmin 离心 l0min。14.小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。除去管闭上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发完，使管内无可见液体。L5.用 50l 含无 DNA酶的胰 RNA酶(20gml)的 TE(pH8.0)溶解核酸，稍加振荡，贮存于-20。(二)对所提取的阳性质粒 DNA进行 PCR扩增鉴
4、定取 0.2ml微离心管编号加入下列成分：10 X PCR buffers 3l引物 2l4dNTPs(25mmolL) 3l待鉴定质粒 DNA 4lddH20 17lTaq酶 1l10 000rmin 离心，5s，混合 PCR反应液。将微离心管置 PCR仪上，935变性 30s，55退火 30s,72.5延伸 90s,30循环，之后725再延伸 7分钟，4保存备用。(三)电泳鉴定 PCR产物1灌胶称取 0.15g琼脂糖，加入电泳缓冲液 15ml，微波炉加热融化。2向胶中加入 4l EB。3向胶灌入事先用透明胶布封好并安好点样疏子的微型电泳槽。4. 胶凝后，点样。取一小块封口膜，加入 l0l
5、PCR 产物及 3l 溴酚蓝指示剂，混匀，点入微型电泳槽上点样孔内。分子量 Mark用 pBR322Hinf I，点样量为 2l DNA 加 8l 电泳缓冲液加 3l溴酚蓝示剂，也可用 DL2000直接点样 5l。 5. 50V电泳 30分钟紫外灯下观察结果。三、试剂1STET0.1molL NaCl10mmolL Tris-HCI(pH8O)lmmolL EDTA(pH8.0)5% Trilon X1002溶菌酶(10mgm1)溶菌酶 10mg，加 lOmmolL Tris-HCI(pH8O)至 1ml.33molL 乙酸钠(pH52)无水乙酸钠 20.4gddH2O 10ml用冰乙酸调 p
6、H52，加 ddH2O定容至 50ml4无水乙醇5. 70乙醇6胰 RNA酶(20gml)lOmg胰 RNA酶，加 lml lOmmolL Tris-HCl(pH7.6)、15mmolL NaCI 中，配成10mgm1 的浓度，于 100加热 15min，缓慢冷却至室温，分装成 100l 包装保存于-20。使用前，取一微离心管，加入 3l lOmgml 胰 RNA酶及 15l TE 缓冲液，混匀，即成含 20g/ml 胰 RNA酶的 TE.lmmol-bffTA(pH8r，)7. TE缓冲液（PH8.0）10mmol/L TrisHCI(PH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)8电泳
7、缓冲液：40mmolL TrisHCI(pH8O)20mmolL NaAC2mmolL EDTA配制方法：先 50倍电泳缓冲液,用时取 5ml，重蒸水稀释至 250ml。50倍电泳缓冲配制方法：Tris 121.1g无水 NaAC 41.0gEDTANa 2 18.6g先用 100ml重蒸水加热搅拌溶解后再用冰乙酸调节 pH至 8.0(大约 25毫升)然后加蒸水定容至 500ml。11kgcm 2灭菌 20分钟。9溴酚蓝指示剂：称取溴酚蓝 200mg，加重蒸水 10ml，在室温下过夜，待溶解后阵称取蔗糖 50g，加蒸馏水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后加重蒸水定容至 lOOml，加 10molL
8、 NaOH 12 滴，调至蓝色。10EB：(10 mgml 溴化乙锭)配制方法：溴化乙锭 1 gddH2O 100 m111琼脂糖12，pBR322/Hinf I分子量大小(bp):163,517,506,396,344,298,221,220,154,7513DL2000分子量大小(bp):2000、1000、750、500、250、10014氨苄青霉素氨苄青霉索(Amp)临用时用无菌水配制在无菌试管中，浓度为 lOOmgml.四、仪器与器材1微型台式高速离心机2. 0.5ml微离心管31.5ml 微离心管40.2ml 薄壁离心管(PCR 管5. 微型电泳槽6电泳仪7微波炉8微量加样器9微量加样器吸头(Tip)10牙签10吊菌环11培养皿12试管五说明对可能含目的基因的克隆菌进行鉴定睥方法很多，经常合并使用，一般是提取 DNA后，对 DNA进行酶切，使其线性化，根据其分子量大小初步判断，然后用两种酶酶切，观察是否能获得与设汁大小一致的酶切片断；选一步鉴定可用本实验采用的 PCR进行扩增，最全面的鉴定方法是对所得到的质粒进行序列分析，这样可完全确定克隆是否正确，并可确定插入片段的方向性。
