1、实验十一 注射用胰蛋白酶效价测定一、实验目的1 掌握胰蛋白酶活力的测定方法-酶速率测定法。2 掌握紫外分光光度计的原理和使用方法。二、实验原理N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯为底物，用紫外吸收法进行测定的原理是：N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯在波长 253nm 下的紫外吸收远远弱于苯甲酰 L-精氨酸。在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰 L-精氨酸逐渐增多，反应体系的紫外吸收随之相应增加。2010 版药典指出胰蛋白酶注射剂中含胰蛋白酶的活力单位应为标示量的 90.0%-120.0%；若按干燥品计箅，则每 1mg 中胰蛋白酶的活力不得少于 2500 单位。酶活单位定义：在底物 B
2、AEE 浓度 1mmol/L，光程 1 cm，波长 253nm，温度 25，测量体积 3ml,.条件下吸光值每分钟递增 0.001（A/min=0.001）为 1 个 BAEE 酶活单位。三、试剂与器材1.材料胰蛋白酶注射剂：规格（1)1. 2 5 万单位 （2)2. 5 万单位 （3)5 万单位 (4)10 万单位N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯盐酸盐2.试剂(1)0.001mol/L 盐酸溶液：取 12mol/L 的浓盐酸 83.33ml 与 916.67ml 蒸馏水混合。(2)0. 067mol/L 磷酸二氢钾溶液：取磷酸二氢钾 9.112g 溶于 1000ml 蒸馏水中。(3)0.
3、 067mol/L 磷酸氢二钠溶液：取磷酸二氢钠 8.04g 溶于 1000ml 蒸馏水中。(4)磷酸盐缓冲液：0. 067 m o l / L 磷酸二氢钾溶液 13mL 与 0. 067mol/L 磷酸氢二钠溶液 87ml 混合，pH 值为 7. 6。3.器材试管及试管架、移液管、100ml 容量瓶、紫外分光光度计等。四、实验步骤1.底物溶液的制备取 N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯盐酸盐 85.7mg，加水溶解使成 100m l，作为底物原液；取 10ml，用磷酸盐缓冲液稀释成 100ml ， 用紫外- 可见分光光度法（ 附录 IVA ) ， 恒温于 25. 0C 0 . 5C ，以水
4、作空白，在 253nm 的波长处测定吸光度，必要时可用上述底物原液或磷酸盐缓冲液调节，使吸光度在 0. 575-0. 585 之间，作为底物溶液。制成后应在2 小时内使用。2.供试品溶液的制备取本品 5 支，分别加适量 0 .001mol/L 盐酸溶液溶解，并全量转移至同一 100ml 容量瓶中，用上述溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取适量，用上述溶液定量稀释制成每 lml 中约含 50-60 单位的溶液。3.测定取底物溶液 3.0ml ，加 0.001mol/L 盐酸溶液 20l 混匀，作为空白。另取供试品溶液200l，加底物溶液（恒温于 25. 01：0. 5C)3. 0ml，立即计时，混匀，
5、使比色池内的温度保持在 25C 士 0.5C，照紫外-可见分光光度法在 253nm 的波长处，每隔 30 秒钟读取吸光度，共 5 分钟。以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，作图；每 30 秒钟吸光度的改变应恒定在 0.015-0.018 之间，呈线性关系的时间不得少于 3 分钟。若不符合上述要求，应调整供试品溶液的浓度，再作测定。在上述吸光度对时间的关系图中，取成直线部分的吸光度，按下式计算：P=(A1-A2)/0.003TW式中：P 为每 l mg 供试品中含胰蛋白酶的量，单位；A1 为直线上终止的吸光度；A 2 为直线上开始的吸光度；T 为 A1 至 A2 读数的时间，分；W 为测定液中含供试品的量，mg；0.003 为在上述条件下，吸光度每分钟改变 0 . 003，即相当于 1 个胰蛋白酶单位。五、数据记录及处理时间 30 1 130 2 2303 3304 430 5吸光值六、注意事项每 30 秒钟吸光度的改变应恒定在 0.015-0.018 之间，呈线性关系的时间不得少于 3 分钟。七、思考题1.酶的试验为何设对照又要设空白?2.稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原因。3.如何保证本实验测定数据的准确性？
