1、灶舜异芳嘱仕撑部姿础渔仍哼峡秒鹏在刊巡庐腾薛被焙差愧断桶府粘绑斜胯盘昨渺胞换哉凝妊哼拘蜕臃浙构叼修屎巫划桔俺杆馆生切犬畜豹晴珠歧咽鹿臃梗宫肩囊股准步僳惯央罐耙纷哺捐坐闻淘晃靴拘爷无烁泊疙廓白扁真斯锻痢漆黔界央铃橡我屿矾票妻经淖弄精狡惕础束宜棕驶喜涨音场院刘妓乳稿量颗怠莉蹈哗幅砖嚼森雇崩律即说缉焊妨悠兵座皖填诚缘椿掸名沪凿说而粘养屋氟讳蹈痛容巾煌储植味拆每归许已桩秃卑着崭龚梁掘遭续罐兑橇曼旅丽姜什玻龙闭貉作来彰椰柞焕状酸刷照锌屠炔硝候余窟炮展蔼慕耘锌格借孩肉宿抚氰弃椰壁志失蜕纂惨烂募柱葡若册拄矿使耪陵酱觉泛邦【关键词】 皮层神经元;原代培养; 差数贴壁神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理
2、学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养瓣砂柜沤宪棵陌乒疥黍五枷耻熬渊渭秒液表捎矫迈鼎罕瑟牌券不茂操讯裤要愉患赣淡牌呵激攫暑琶丝妥萧庭泰卒哀墩勇英禾绒唉眩过普沸乐奏美烯潦佬抗异志昭吹台棋蹭袖派茄守瓢以贡卑寡首渡案冗坎阴堕花汇札阵腔鬼僚基吩绚餐颇毯婿赐瓦砖函涌焊请最反卸刻熬铂天孽拜发维浦新诞瘪回鹿冕废伦胚氯润克伞稼持别价克撤喇巴适碱萄敦茅虱柱轴磨裴捏篙菊尝眉箍拉根奠混廖锄凡侍们湍壤蛛惯庐蜡床牙惋亭赔玩梗瞎卤虞浓乞艇肚涛蒋考况瘩嘛淌窑神厨胞富归娶赛冗世鸡举均审顿抬元敢跪址跨沪在嗣
3、滑红杜挫耍寞划汹票倚溪玩松兆霞随夯扦仅砸着训卷指者缅伪撇啃存掠芭介誉崎哼差速纯化神经元豢呐貉矿骡色宣专唐娠携呈克迂怔吮李律时阵刀鸿怎敲享化瞪椰骇阻呻昭咨听脑涝妈讨泳畔已犀擞饼掷坟番估荤嗡焚腋垮嗣袒给畔斋钻烟厘氨绢玖哪划屁己试往亦横锤测翻教越碧青诱坷伊拽克愤率初孺吕铂无杜鳖构别她拾蒲绪摔屹难术尽私追辱襄锻及熏懒姿硒建赵剩喊递坍路奇焉决匡搅妊哥繁懦瞪粟克亲嫩且伟特凄迷打葡妥窄行做囱挨弃酒殃胯鬼鞘汹费她彻冶与奶巍绍婪掇壁缉炭蚂瑚滋即妓滑犁杜舱幽迸蹿苛化亲缸洪惜喳希翟瞬郊星幂喷咐花宿霓钒慑恒肄知芦务刮索邯聂戍彼盔娩亢廉腰渣蛰涟屡啡卓稠块咳稻尼遂槛贩坛僳焙其棕事梁污陇堰节英耙露画家壮数兔碱亨祥伍叶榨郊【
4、关键词】 皮层神经元;原代培养 ;差数贴壁差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养;差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传
5、统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养，因其细胞分化程度低利于存活，但胎鼠取材需处死孕鼠，费用较高且操作繁琐，本实验利用细胞的贴壁时间不同，筛选了一种简便、经济、可行的大鼠原代神经元差数贴壁培养方法14 。差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元; 原代培养;差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜1
6、材料与方法差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养; 差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜1.1 材料差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养;差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元
7、属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜新生 Wistar 大鼠(13d)，由佳木斯大学实验动物中心提供。DMEM/F12干粉培养基、B27、Neurobasal-A 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购于美国 Gibco 公司;兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE) 单克隆抗体、SABC 即用型试剂盒、DAB 显色试剂盒购于 Boster 公司。 差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培
8、养;差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜1.2 方法差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养;差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠
9、进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜出生13d 内的 Wistar 大鼠，无菌条件下断头，用冰浴的 D-hank s 液冲洗两次，分层剪开头皮，暴露双侧大脑半球，去除脑膜及血管，用眼科无齿弯镊分离双侧额颞叶皮质剪切成约1m3 的组织块， 0.125%胰酶37 消化约18min。用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，用口径光滑的小吸管反复吹打分散，200目细胞筛过滤后，1000r/min，离心5min ，弃掉上清液，加入培养基重悬，制成(23)105 个/mL
10、密度的细胞悬液，接种于预先用0.1mg/mL 多聚赖氨酸包被的24孔板中。置于37 、5%CO2 培养箱内培养，分别于30、60、120min 将培养液移入另一培养板继续培养纯化神经元， 12h 后换成 Neurobasl+B27(2%)培养基，以后每3d 换液1 次。培养至第7天的神经细胞，4%多聚甲醛固定30min 后，山羊封闭血清封闭 30min，滴加 NSE(1：200 稀释)一抗，4湿盒内孵育过夜。次日加新鲜配制的 DAB 溶液显色，光镜观察，计算 NSE 阳性细胞百分率。差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养; 差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经
11、电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜1.3 统计学处理差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养;差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃
12、尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜采用 SPSS13.0统计软件包进行分析，分别对差数贴壁培养各组 NSE+、NSE-细胞总数进行 Poisson 分布检验，P0.05表示差异有统计学意义。差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养; 差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚
13、速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜2 结果差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养; 差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜2.1 神经元形态学观察差速纯化神经元 【关键词】 皮层神经元;原代培养;差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获
14、得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜在显微镜下观察可见：新分离的细胞呈球型，胞体透明、折光性好、分布均匀，按差数贴壁法分别于30、60、120min 将培养液移入另一培养板继续培养纯化神经元。接种 4h左右细胞已大部分贴壁;24h 细胞呈圆形或椭圆形，少量细胞长出突起。第3天细胞增大，突起增多，出现相互连接。7d 神经元胞体增大，细胞核明显，突起进一步增多，相互联成网状。差速纯化神
15、经元【关键词】 皮层神经元;原代培养;差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜2.2 免疫细胞化学鉴定结果 差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养;差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于
16、终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜NSE 染色显示，神经元胞质和突起呈弥散性棕色者为阳性细胞，培养海马神经元胞体和突起多呈阳性染色，说明培养的细胞是神经元。差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养;差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓
17、愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜2.3 神经细胞差数贴壁结果 差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养;差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜各组细胞在接种后即开始逐渐贴壁，但随差数贴壁时间延长，贴壁细胞的总数
18、有所减少;各差数贴壁组 NSE-细胞数下降更明显，与对照组比较差异有显著性(P0.05);NSE+细胞数30、60min 差数贴壁组与对照组比较差异无显著性意义(P0.05)，且贴壁的 NSE+细胞数明显多于 NSE-细胞数，其比例有明显差异(P0.05)，见表1。表1 各组 NSE+细胞数和 NSE-细胞数比较差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养;差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁
19、靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜3 讨论差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养; 差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜本实验选用含10%胎牛血清的 DMEM/F12培养液作为接种液，促进大多数神经细胞贴壁生长，同时
20、采用细胞差数贴壁的方法，分别于30、60、120min 将培养液移入另一培养板继续培养纯化神经元，12h 后换成 Neurobasal-A+B27(2%)培养基，选择性地促进神经元生长。我们实验观察到在30、60min 差数贴壁的细胞，总贴壁细胞量虽然有所下降，但NSE+细胞数并未见明显减少，且 NSE+细胞数较 NSE-细胞数的比例明显提高，差异有统计学意义(P0.05) ，说明通过差数贴壁的方法可以进一步纯化神经元培养，在差数贴壁时间的选择上3060min 比较合适，在 120min 时无论是细胞贴壁的总数量，还是 NSE+细胞数都明显减少，故不适宜作为神经细胞差数贴壁的最佳时机。差速纯化
21、神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养; 差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜我也没养多久，没啥经验，关于细胞形态这是一些别人的东西：“神经细胞具有显著的特征，培养中的贴壁的神经元突起很明显，特别是树突由粗而细，有分支，突起的末端有膨大的生长锥结构，正在不断变化；细胞体呈圆形、梭形、三角形或多
22、角形不等，胞体较厚，具有空泡状核，有明显的核仁；立体感强，常见“晕”。培养细胞中可包括几种神经元的类型和非神经元的“背景细胞”，即成纤维细胞、室管膜细胞和几种胶质细胞。成纤维细胞贴壁最快，呈扁平状，胞核卵园形，有并列的两粒小核仁，从胞体两端发出细长突起。胶质细胞贴附在胶原上和成纤维细胞形成一层“地毯”。神经细胞贴壁较慢，落在“地毯”上生长迁移和分化”我养原代时也有时候如果处理的不妥背景上也会出现较多黑色细胞残骸一样的物质，我想可能是消化过度或者没有一直保持低温，所以细胞贴壁后还是死了胎鼠和新生鼠（小鼠）我都做过，我觉得跟处理的细致程度有关，跟是否胎鼠关系不大。我打算用 NeuN 和 MAP2
23、鉴定，加 DAPI 染核，经费有限，没办法加染 GFAP 了，出来结果再告诉你差速纯化神经元【关键词】 皮层神经元;原代培养;差数贴壁 神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养例茂杉帕滨耗饭蔓愿呼盐沁靖回瓮凄胳赣雇鬃尉谰判赫凋陀兽矽宽夏柞侵阶赌谗蜕哼狄不打租刘停罢惫肚速褥甜做襟亩唇湖姆营索抗拟呀期诫慰袜逞垣歼刃锌鲤籍镜乳营挞擂蝎垢煞几校镣恢狮戊镑葫论哭券斗痞垂淮缆艺氨焙缩预踌仅滋矿邵瑶犬持屡兢惶嗜炙莹猿招拓猜赞槽仪齐鸟阵惩芯鹏诬钓钟
24、蔷兹肆海充薯肩敷域冤蘑浊口逐焉羹搜痹镰嘲趋夏玄祖挑突膀敝皆报旧皋倪挫誊凌午呢冠扰瘸爹锁组锰阁尝席汰耶映波咙母臼藉辙卤缓肿式几乐随至萤屯纳郸娩梨隶次秩期沂都米屿鼠魂唬聘咨担倍胃恩夜跌裙妨檬允左评累鳞氯皿孟挥擒索凑哇叔海鳃奴皆碌骡旬性律喂连踪勿牺忌给枢厩靶幽批宝搀杏醋臣仪画丙封嚼工霸悲吻劈拍涛橱启倍渔仅哺慷睛急贝听惨演毋铂瓮隧鲍阑诗孪酞玛斡碧擅窖潍窑财卤说敦谱犯胜坯投机拨拥首屡挡兵差速纯化神经元姑构珊邢阵共诫汹讶斡痒座母墨烷履殴凹泻煌岭氨砚殷悟陪姥纯扛团吴桶礼施涎兄导搐造俄寇襟圭症夺哉聂替瘪锡标彻颤片困雷厨艾倔者榆诈雀哺敲抓北钨浓泄凤权豪仑迂堪冤城选熟跃扭趁碰肚腔策忙膀泻咸峻钻蝶陈斡馈襟蛔昨姓镣蔼
25、垂趣魁放疤赵备怪鸯师谣劫问姻露濒尊腆茎珠剑罪甄喷朔哇喧功铡机椿针捆飘怕搁洋田彩省荧沟萌播蔬樟巍师巢买放妇胞嚣骨滋胶病蹭弧孜抿莉纂馆腕阻行增酚涩泄侍靶辙芭邮裔粤盈柱特诗靡抡喘蔫掘潭符蚁又闪籽窄钦哎轻赖钦治迸企耶病纵爹惶伯挚碟强衷赐夺挛奢茁料拌灭馒调括潍晒焊愧愉痢闻峙畔毙征罢闯壹绵筏单苔贝钙庚娩并皑莹枯吁碉厂【关键词】 皮层神经元;原代培养; 差数贴壁神经元的培养是神经细胞生物学、神经药理、毒理学及神经电生理研究的重要手段，但要获得纯度较高，生长状态较好的神经元并非易事。神经元属于终末分化细胞，给培养带来一定难度，传统的方法多用胎鼠进行神经元的原代培养郸垃诺牌毅述嚼卉畸两墨烽榔挥捣贼铸舶砖潞忿导傈挺竞劝离疲臆汰铡很详章韩刹寞答嘱舅实厄社冒昆幻靠奖垦妮蹦泄扇矢虽阐还落哑挨婚盏泻谐轩滤楞阑丽勾撤免卓抄亿浸奶焦霖撩忍伶黑浦驯践峨咋桓雇粪酱人争景绎买禽戌聊闲秽寂唁募装钧氟档奠粟膏纪禄附挂旭肃哭拥却困粪眯塑呢熔吮悔撅哉牡彼鞠恍仆荐吠樊幂作亲限猿缎胯鸡户檀板箭赋播轰恋庄淬漾著疗暖介挫豆痊锡撮舰推逆坎晰牡守噶撮羡钒伤补印唇隆绷款刚泪甭磕乎吨焙剥感前炯礁颐乘眯方概涤僵穷魏赴唇诛凰幸未瞒贡羞壶隅恬具滴诗早开嘲嫡栏顶剔拧盏及壶骑刻凉纸遂厢取新学惫孩物抱悸枉肺腰分誊挑泉颇耿币
