1、目 录摘 要 3ABSTRACT4前 言 51. 转 BT 基因抗虫植物研究进展 52.转基因植物对寄生性天敌的影响 53.玉米螟厉寄蝇的研究进展 63.1 玉米螟厉寄蝇生物学研究.61. 材料与方法 .81.1.实验材料 81.1.1 供试药剂.81.1.2 实验仪器与设备 81.1.3 供试虫源 81.1.4 主要试剂的配制 91.2 试验方法 .101.2.1 酶源的制备 .101.2.2 -乙酸萘酯酶活力测定 101.2.3 乙酰胆碱酯酶活力测定 .101.2.4 谷胱甘肽-S-转移酶活力测定 111.2.5 酸性磷酸酯酶(ACP)活力测定(Bessey 法)111.2.6 碱性磷酸酯
2、酶(AKP)活性测定 111.2.7 酶源蛋白质含量测定 .112 结果与分析 .122.1 酶源蛋白含量测定 .122.1.1 蛋白质标准曲线 .122.1.2 源蛋白质含量结果 .122.2 CRY1AC杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内 -乙酸萘酯酶活性影响 132.2.1 -萘酚标准曲线 132.2.2 取食 Cry1Ac 杀虫蛋白玉米螟厉寄蝇体内 -乙酸萘酯酶活性影响测定结果.132.3 CRY1AC杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内乙酰胆碱酯酶活性影响 .132.3.1 还原型谷胱甘肽标准曲线132.3.2 Cry1Ac 杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内乙酰胆碱酯酶活性影响测定结果.142.
3、4 CRY1AC杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内谷胱甘肽-S-转移酶活性影响结果 142.5 CRY1AC杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内酸性磷酸酯酶活性影响 .152.5.1 对硝基苯酚标准曲线152.5.2 Cry1Ac 杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内酸性磷酸酯酶活性影响结果.152.6 CRY1AC杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内碱性磷酸酯酶活性影响 .162.6.1 对硝基苯酚标准曲线162.6.2 Cry1Ac 杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内碱性磷酸酯酶活性影响结果.163 结论与讨论 .16参考文献 .18致 谢 .19摘 要玉米螟厉寄蝇是玉米螟幼虫期重要的寄生性天敌之一，转 Bt 基因
4、抗虫玉米在对玉米螟等靶标害虫产生毒害和控制作用的同时，对玉米螟的寄生性天敌也可能存在危害作用。玉米螟取食转 Bt基因的植物组织后，体内生理生化都发生一些变化，有可能会针对 Bt 蛋白胁迫产生抗性进化，这些生理生化变化对于寄生玉米螟体内的玉米螟厉寄蝇的影响是直接的，玉米螟厉寄蝇是否能产生相应的协同抗性进化，目前国内外还没有相关报道。解毒酶系的变异是昆虫取食适应性的最重要形式之一，解毒酶的变化可能改变其对直接接触物质的敏感性。本章实验在室内研究了 BtCry1Ab 毒蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫几种主要解毒酶系活性的影响，以便为 Bt 制剂的环境安全性评价提供参考。关键词：解毒酶；玉米螟厉寄蝇；影响Ab
5、stractBt preparations and turn Bt gene on insect resistance corn borer target pests such as control action generated poisoning and at the same time，the parasitoids of di hazards role. There may also be Di di sent flies is greatly larva stage one of the important parasitoids, feeding the resistibilit
6、y turn Bt gene plant tissue, physiological and biochemical occurs some change, likely resistant against Bt protein stress evolution, these physiological and biochemical changes in the body for parasitic di di influence is complete send flies directly, acquire di sent flies whether can produce corres
7、ponding collaborative resistance evolution at home and abroad have not reported. Detoxifying enzymes department variation is the most important insect herbivory adaptability, detoxifying enzymes form of the changes may change its direct contact with the sensitivity of the matter. This chapter experi
8、ment in the laboratory Cry1Ab ribosome-inactivation protein the Bt di sent several main adult flies greatly influence of enzyme activity detoxification, so as to the environmental safety evaluation Bt preparations to provide the reference. Keywords: Detoxifying enzymes; Di sent flies develop ; influ
9、ence前 言玉米是营养丰富的粮食作物，发展玉米生产对改善我国人民的食物结构，满足对植物蛋白的要求，发展畜牧业、食品都有十分重要的意义。亚洲玉米螟是我国玉米作物上的重要害虫，是影响农业生产持续稳定发展的重要限制因素，玉米螟有多种天敌。经多年观察，寄生率较高的是玉米螟厉寄蝇，属于寄蝇科，寄蝇科的学名词干来自希腊文“Tachys” ，原意是“迅速的” ，系指成虫的飞行特点，由于其幼虫全部寄生于其它昆虫或节肢动物体内，故中文命名称之为寄蝇 2。玉米螟厉寄蝇在国内的寄主有：玉米螟、三化螟、玉米蛀茎夜蛾。属双翅目，寄蝇科 3。由于长期过量使用化学农药，引起各种各样的问题。尤其是抗药性的问题，玉米螟抗药性
10、的提高和防治效果的下降是造成玉米螟猖獗危害的主要原因之一 4。转 BT 杀虫蛋白基因抗虫玉米的广泛种植有效控制了玉米螟的危害。但转基因抗虫作物并非为自然界天然存在的物种，这些作物的培育和大面积种植在解决人类面临的食物、资源等重大社会经济问题的同时，也对生态系统存在潜在的危险，它将直接或间接的影响农田生态系统的生物多样性和生物群落结构的变化以及生态系统的平衡。因此，转基因抗虫植物对生态环境的安全性备受瞩目，转基因抗虫植物对农业生态系统中有益生物的影响是其生态风险评估的重要内容之一。因为农作物生态系统中既有害虫又有害虫天敌，天敌在抑制害虫种群数量中发挥着重要作用。本文以玉米螟为寄主，在实验室研究了
11、 BT 杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫解毒酶的影响。1. 转 BT 基因抗虫植物研究进展化学农药的长期使用对人们生存环境的影响越来越大，农药残留问题尤为严重。人体长期使用带有农药残留的食品、蔬菜、水果之后会出现各种各样的疾病，导致得癌症的人群不断扩大。随着人们食品安全议事和环境保护意识的增强，人们对具有高度专一性、对人畜和天敌安全、不破坏环境的生物杀虫剂的开发越来越重视 5。科学家对此做出长期不懈的努力，随着生物技术日新月异的发展，一种新型高效的抗虫方法随之产生，转基因植物的出现给农业生产带来了新的革命。1996 年全球转基因植物种植面积只有 1.7 百万公顷，而 2003 年增长到 67.7 百
12、万公顷，以 40 倍的速度增长。其中百分之三十由发展中国家种植。2002 年全球有 6 百万农民，16 个国家种植转基因作物，而 2004 年全球有八百万农民，17 个国家种植转基因作物，其中 99%由美国，阿根廷，加拿大，巴西，中国和南非种植。种植的转基因作物主要是玉米，棉花和大豆 6。众多研究认为转基因玉米能有效控制靶标害虫的危害，对非靶标作物危害影响小，不存在环境污染问题，投资较少，并且可以控制任何时期任何部位发生的虫害 7。2.转基因植物对寄生性天敌的影响自从年第一株转基因植物诞生以来，至今各种类型的转基因植物进入大田试验的已不计其数，近种转基因作物的产物已经商品化。与此同时，转基因植
13、物向环境释放后可能带来的生态风险问题也越来越受到人们的重视 8。关于转基因植物的生态风险或对环境的危害，科学家提出了不同的概念和测试方法。生态毒理学的经验以及年代发展起来的，为作环境决策用的生态风险评价的经验可以借鉴以作转基因植物生态风险的评价。随着转基因作物的大面积推广，其生态风险和安全性问题受到人们越来越多的关注，关于转基因抗生作物对自然天敌的研究领域也是这几年的热点，但是众多研究报道的后果不尽相同，尤其关于转基因植物对寄生性天敌的研究后果很不一致，转基因植物对寄生蜂的影响要从寄生蜂的行为和生理方面来衡量 9。转基因植物对寄生蜂的生理影响包括 BT 毒素对寄生蜂的直接影响和因为寄主品质的下
14、降而对寄生蜂造成的间接影响。一般认为 BT 杀虫剂对非靶标昆虫无毒副作用，而且一致认为害虫综合治理体系中的重要成分被长期使用，但传统 BT 杀虫剂与 BT 基因植物不同。前者包含几种 BT 原毒素以及活细菌芽孢，而目前商业化种植的转基因植物表达一种已部分活化的 BtcryCA 杀虫蛋白，具有专业性更高、毒性强、毒蛋白在植物整个生长期的大部分器官中表达等特性 10。因而种植转基因植物不但要控制靶标害虫而且必须与天敌协调共存，才能融入有害生物综合治理体系 11。转基因抗虫植物可能直接或间接影响寄生性天敌的生长发育和行为。直接影响可能通过二种方式产生：（1）大部分寄生性天敌的幼虫依赖寄主害虫的营养而
15、完成生长发育。某些寄生性昆虫的成虫也可以直接取食寄主 12，而且多数寄生性昆虫在成虫期具有补充糖类营养的习性，其中植物花蜜是主要来源 13。 （2）寄生蜂主要依赖于植物受到寄主昆虫取食危害后释放的信息来搜寻寄主 14。如果转基因植物释放的信息素发生了变化可能会影响寄生蜂的寄主搜寻行为，转基因抗虫作物可能因外源基因插入而导致其体内化学组分，特别是挥发性物质组成的变化从而影响寄生蜂的搜寻行为。间接影响主要表现为以下几个方面：（1）转基因抗虫作物由于降低了靶标幼虫发育以及某些成虫阶段具有吸食寄主习惯的寄生蜂的寿命和生殖力 15，甚至抗虫作物的寄主由于营养质量降低而体型变小。根据“寄主体型大小-质量”
16、模型预测，寄生蜂可能产更多的雄性后代 16，从而影响后代寄生蜂种群的性比。 （2）取食转基因抗虫作物的寄主体型变小，会影响寄生蜂的寄生功能反应，寄主体型大小可能与寄生蜂的功能反应存在关联 17。3.玉米螟厉寄蝇的研究进展3.1 玉米螟厉寄蝇生物学研究雌虫：体长 5.50-8.50 毫米。复眼裸。触角芒基部 2/3 加粗；第三节为第二节 2倍。额鬃排列 2-3 行。有 3-4 根下降至侧颜排列成一行，斜向复眼，占侧颜上方 1/3。颜堤略向上拱起，基部 1/3-1/2 具细鬃。中胸背片和小盾片覆浓厚的灰白色粉被。腹部黑色，各节背板沿后缘具一宽阔的黑色横带。第三、四背板各具 1 对中心鬃。浓厚的灰白
17、色粉被占据第五背板基部的 3/5，第四背板基部的 3/5。前缘脉第四脉段差不多与第六脉段等长。雄虫：无外侧额鬃。触角芒基部 3/4 加粗。触角第三节为第二节长的 3-4 倍。前足爪很短，显著短于第五跗节 18。雌虫寿命 5-12 天；雄虫 4-10 天。成虫一般白天活动，夜晚静止不动，天气炎热的中午只在较隐蔽地方活动。取食花蜜和果汁。雌虫以产卵器刺破玉米螟幼虫体壁，将卵产在玉米螟体内，幼虫在寄主体内取食、化蛹，羽化后破蛹壳而出。玉米螟幼虫被寄生时，约半小时内不活动，以后又照常取食，约经 8 天左右腹部变粗，活动迟缓，躯体易僵硬。玉米螟厉寄蝇的幼虫期一般为 10-12 天。蛹期 6-15 天 1
18、9。1. 材料与方法1.1.实验材料1.1.1 供试药剂曲拉通-100（Triton-100） 北京鼎国昌盛生物技术有限公司坚固蓝 B 盐 北京鼎国昌盛生物技术有限公司还原型谷胱甘肽 北京鼎国昌盛生物技术有限公司对-硝基磷酸二钠 北京鼎国昌盛生物技术有限公司-乙酸萘酯 北京鼎国昌盛生物技术有限公司-萘酚 北京鼎国昌盛生物技术有限公司十二烷基硫酸钠（SDS） 北京鼎国昌盛生物技术有限公司对-硝基酚 北京鼎国昌盛生物技术有限公司碘化硫代乙酰胆碱 北京鼎国昌盛生物技术有限公司二硫双对硝基苯甲酸（DTNB） 北京鼎国昌盛生物技术有限公司巴比妥钠 北京鼎国昌盛生物技术有限公司毒扁豆碱 北京鼎国昌盛生物技
19、术有限公司1-氯-2， 4-二硝基苯（CDNB） 北京鼎国昌盛生物技术有限公司牛血清白蛋白（BSA） 沈阳-精细化学品有限公司考马斯亮蓝 G-250 沈阳-精细化学品有限公司乙二胺四乙酸（EDTA） 国药集团化学有限公司1.1.2 实验仪器与设备双目解剖镜、养虫室、培养皿、容量瓶（10mL、25mL、50mL、100mL、250mL、500mL、1000mL） 、小烧杯、大烧杯、移液管（1mL、2mL、5mL、10mL） 、移液枪（10uL、10-100uL、100-1000uL） 、三角瓶生化培养箱离心机（TL-18M） 、分析天平（BS210S） 。紫外/可见分光光度计（UV-100，UV
20、/V-1200 型）上海美谱达仪器有限公司1.1.3 供试虫源 玉米螟是由本实验室饲养。玉米螟厉寄蝇为 2010 年 4 月采自沈阳农业大学试验田及周边农田，在本实验室以玉米螟为寄主繁殖。繁殖方法：寄蝇羽化展翅后，镜检分辨雌雄，将当天羽化的雄蝇放入20cm20cm20cm 单独分笼饲养。刚羽化的雌蝇及时放入已羽化 1 天以上的雄蝇笼内进行交尾。用 5%稀蜂蜜液和牛奶进行饲喂补充营养。受精雌蝇经过 9-11 天后卵在子宫内全部发育成熟（即自然产蚴高峰期的后期） ，人工剖腹取蛆和接种。将接种后的玉米螟放入化蛹纸内，保持一定的湿度。6-8 天后玉米螟厉寄蝇从寄主残骸脱出化蛹。试验昆虫的饲养条件：温度
21、白天 25-30，晚间 22-24；相对湿度 70-90%，光周期14L:10D。1.1.4 主要试剂的配制1、0.2moL/L 磷酸缓冲液A 液 0.2 moL/L NaH2PO4 35.814g 定容 500mLB 液 0.2 moL/L Na2HPO4 15.601g 定容 500mLPH 0.2 moL/L NaH2PO4 0.2 moL/L Na2HPO47.0 39.0 61.08.0 5.3 94.72、0.04 moL/L PH=7.0 磷酸缓冲液：取 0.2 moL/L PH=7.0 的 PBS 5 倍稀释。3、0.1 moL/L PH=8.0 磷酸缓冲液：取 0.2 moL
22、/L PH=8.0 PBS 2 倍稀释。4、410-4 moL/L a-乙酸萘酯 称取 -萘酚 0.01442g，先用少量丙酮溶解，再用0.04 moL/L PH=7.0 PBS 定容至 10mL，用时再稀释 25 倍。5、显色剂（现用现配）:1%固兰 B 盐液与 5%SDS 溶液 2:5 混合。6、7.510-3moL/L 碘化硫代乙酰胆碱：取碘化硫代乙酰胆碱 21.69mg 用 0.1 moL/L PH=8.0 磷酸缓冲液配制成 1L 溶液（现用现配，防止水解） 。7、0.01 moL/L DTNB（含 1.810-2moL/L NaHCO3）：取 39.6mgDTNB 用 0.1 moL
23、/L PH=8.0 磷酸缓冲液定容 10mL。8、110-3moL/L 毒扁豆碱:先配 110-2moL/L 丙酮液（27.5mg/10mL） ，用时用蒸馏水10 倍稀释。9、110-3moL/L 谷胱甘肽溶液：称取 30.7mg 谷胱甘肽，用成蒸馏水溶解定容100mL。10、0.1moL/LCDNB：取 CDNB0.2025g 用丙酮溶解定容 10mL（避光保存） 。11、0.2moL/L PH=4.6 醋酸缓冲液：0.2 moL/L 醋酸溶液与 0.2moL/L 醋酸钠溶液按51:49 混合。12、7.510-3moL/L 对-硝基磷酸二钠溶液：取对-硝基磷酸二钠 0.1392g 用蒸馏水
24、定容 50mL。13、0.5moL/L NaOH 溶液：取 5gNaOH 用蒸馏水定容 250mL。14、0.1moL/LNaOH 溶液：取 0.4gNaOH 用蒸馏水定容 100mL。15、510-4moL/L 对-硝基酚溶液：取 0.139g 对-硝基酚用丙酮定容 10mL 配成0.1moL/L 母液，取母液 0.5mL，用蒸馏水定容 100mL16、0.04moL/LPH=9.6 巴比妥钠-盐酸溶液A 液 100mL 0.04moL/L 巴比妥钠（8.25g 巴比妥钠用蒸馏水定容 100mL）B 液 0.35mL 0.2moL/L 盐酸（1.672mL37%盐酸定容 100mL）17、考
25、马斯亮蓝 G-250 试剂：称取考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50 ml 95%乙醇中，加入 100 ml 85%的磷酸，移入 1000ml 容量瓶中，用蒸馏水定容。18、牛血清白蛋白标准溶液：称取 100mg 牛血清白蛋白，溶于 l00ml 蒸馏水中，即为1000g.ml-1 的溶液。1.2 试验方法1.2.1 酶源的制备取 20 头经过饲喂处理的玉米螟厉寄蝇成虫，放在预冷过的研钵中，加入2mL、0.1mol/L 磷酸缓冲液（含有 0.1% Triton-100）匀浆，匀浆液在 4，14000r/min 离心 30min，去上清液作为酶液，在紫外分光光度计上分析酶活力。1.2.2
26、 -乙酸萘酯酶活力测定参照 Van Asperen(1962)方法。反应混合液中含有 10L 酶液，3.49mL0.04 mol/L 的磷酸缓冲液(PH=7.0)，0.5mL4x10-4mol/L 的 -乙酸萘酯液，在 37水浴中保温 30min，加入 0.5mL 显色剂(0.1%固牢蓝 B 盐与 0.5%SDS 溶液按 2:5 混合)，室温下放置 10min，600nm 处比色。每处理重复测定 3 次，以下均同。酶源经蛋白质含量测定，计算出 -乙酸萘酯酶的比活力。以 -萘酚作标准曲线。表 1.1 -萘酚标准曲线的制备Table1.1 Test of standard curve to 1-N
27、phthol试剂 0 1 2 3 4 5 6210-4mol/L萘酚（ml） 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 20.04mol/L PH7.0 磷酸缓冲液 3.5 3.3 3.1 2.7 2.3 1.9 1.5显色剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5将上表各试剂混匀，室温静置 30min，600nm 下测 OD 值，重复三次。以 -萘酚含量（mol）为横坐标，OD600 平均值为纵坐标，作标准曲线。1.2.3 乙酰胆碱酯酶活力测定参照 Ellman(1961)方法。反应混合液含有 50L 酶液，2.8mL0.1mol/L 的磷酸缓冲液(PH=8.0)，50L0
28、.075mol/L 的碘化乙酰胆碱，0.1mL0.01mol/L 的 DTNB 液，在25水浴中保温 15 min，加入 0.1mL10-3mol/L 毒扁豆碱。410nm 处比色。酶源经蛋白质含量测定，计算出乙酰胆碱酯酶的比活力。用谷胱甘肽作标准曲线。表 1.2 还原型谷胱甘肽标准曲线的制备Table1.2Test of standard curve to GSH试管编号 0 1 2 3 4 50.1mol/L PH8.0 磷酸缓冲液（ml） 2.6 2.5 2.4 2.2 1.8 1110-3mol/L 谷胱甘肽（ml） 0 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6磷酸缓冲液与 DTNB 按
29、 1:2 混合（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1混匀，30中水浴振荡 15min毒扁豆碱（ml） 1 1 1 1 1 1412nm 下测定 OD 值以谷胱甘肽浓度（mol）为横坐标，OD412 平均值为纵坐标，作标准曲线。由于每分子还原型谷胱甘肽提供一个-SH 基团，其显色效应与一分子硫代胆碱相当，所以可以用还原型谷胱甘肽与 DTNB 显色剂制作标准曲线。1.2.4 谷胱甘肽-S-转移酶活力测定参照 Booth(1961)方法。反应混合液含 0.1mL 酶液，2.9mL0.1mol/L 的磷酸缓冲液(PH8.0)，0.7mL0.03mol/L 的谷胱甘肽液，50L0.1m
30、ol/L 的 1-氯-2, 4-二硝基苯（CDNB）液，在 25水浴中反应 30min，加热使其失活，在 350nm 处比色。酶源经蛋白质含量测定，计算出谷胱甘肽-S-芳基转移酶的比活力。1.2.5 酸性磷酸酯酶(ACP)活力测定(Bessey 法)反应混合液含有 0.72mL0.2mol/L 的醋酸缓冲液，0.03mL 酶液，0.15mL 0.0075mol/L 对-硝基磷酸二钠溶液。将混合液混匀后，在 37水浴中振荡 30min，加入 0.6mL0.1mol/LNaOH，终止反应。在 400nm 处比色。以对-硝基酚为底物作标准曲线，重复 3 次。酶源经蛋白质含量测定，计算出酸性磷酸酯酶的
31、比活力。表 1.3 对-硝基酚标准曲线的制备Table1.3Test of standard curve to p-Nitrophenol试管编号 0 1 2 3 4 5510-4mol/L 对- 硝基酚丙酮溶液（mL ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.2mol/L PH4.6 醋酸缓冲液（mL ） 3 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 0.1mol/L 氢氧化钠溶液（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 摇匀，待颜色稳定后，在 400nm 波长下测定 OD 值，以对-硝基苯酚含量为横坐标，OD412 平均值为纵坐标，绘制标准曲线，并求直线回归方程。1
32、.2.6 碱性磷酸酯酶(AKP)活性测定用 0. 4 mol/ L 巴比妥钠-盐酸溶液(PH=9.6)代替醋酸缓冲液，其他同酸性磷酸酯酶活力测定。表 1.4 对-硝基酚标准曲线的制备Table1.4Test of standard curve to p-Nitrophenol试管编号 0 1 2 3 4 5510-4mol/L 对- 硝基酚丙酮溶液（mL ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.04mol/L 巴比妥钠盐酸缓冲液（mL） 3 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 0.1mol/L 氢氧化钠溶液（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 摇匀，待颜色稳
33、定后，在 400nm 波长下测定 OD 值，以对-硝基苯酚含量为横坐标，OD412 平均值为纵坐标，绘制标准曲线，并求直线回归方程。1.2.7 酶源蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝 G-250 法测定(Bradford，1976)，以牛血清蛋白(BSA)为标准蛋白。试剂配制：（1）考马斯亮蓝 G-250 试剂：称取考马斯亮蓝 G-250100mg 溶于 50mL95%乙醇中，加入100mL85%的磷酸，移入 1000mL 容量瓶中，用蒸馏水定容。（2）牛血清白蛋白标准溶液：称取 100mg 牛血清白蛋白，溶于 l00ml 蒸馏水中，即为1000g.mL-1 的原液。（3）0.04mol/LPH=7
34、.0 磷酸缓冲液：同羧酸酯酶比活力的测定。表 1.5 蛋白质标准曲线的测定Table1.5Test of standard curve to protein试管编号 0 1 2 3 4 51000g.ml-1 牛血清蛋白（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1蒸馏水 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0蛋白质含量（g） 0 200 400 600 800 1000准确吸取上述各试管中溶液 0.lmL 于试管中，再加入 5mL 考马斯亮蓝 G-250 试剂，25水浴 2min，595nm 下测 OD 值。以牛血清白蛋白的含量（ g）为横坐标，以 OD值为纵坐标，绘制标准曲线。酶源蛋白质
35、含量的测定:吸取酶液 0.lmL 于试管中、对照管中则加入 0.lmL 磷酸缓冲液，加入 5mL 考马斯亮蓝 G-250 试剂，混匀，25恒温水浴下放置 2min，在 595nm下比色测 OD 值。重复 3 次，取平均值，根据标准曲线计算出每毫升酶液含有的蛋白质含量。2 结果与分析2.1 酶源蛋白含量测定2.1.1 蛋白质标准曲线图 2.1 蛋白质标准曲线Fig2.1The standard curve of standard protein2.1.2 源蛋白质含量结果表 2.1 不同浓度处理酶源的 OD595 值Table2.1 The OD595 of enzyme treatments
36、at different dose饲喂时间酶源蛋白含量（g/ml） 1d 2d 3d 4d 5dCK 39755 38531 27946 21643 23270 125 41453 39629 21003 19968 22291 250 38641 38791 27591 21351 23491 500 38657 36848 35577 22559 24305 2.2 Cry1Ac 杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内 -乙酸萘酯酶活性影响2.2.1 -萘酚标准曲线图 2.2 - 萘酚标准曲线Fig2.2The standard curve of 1-Nphthol2.2.2 取食 Cry1Ac
37、杀虫蛋白玉米螟厉寄蝇体内 -乙酸萘酯酶活性影响测定结果由表 2.2 可知，从不同处理中比活力随时间的变化趋势来看，125g/ml 处理与250g/ml 处理的 -乙酸萘酯酶比活力在第 3 天出现一个高峰，与对照差异显著，其余时间均显著低于对照或与对照相近；500g/ml 处理的 - 乙酸萘酯酶比活力在第 2天突然升高，随后逐渐降低到与对照相近水平。说明 -乙酸萘酯酶对 Bt 毒蛋白有明显的应激反应，而且随毒蛋白浓度的提高，反应时间也相应提前。表 2.2 饲喂含 Cry1Ab 杀虫蛋白的蜂蜜牛奶液后玉米螟厉寄蝇体内 -乙酸萘酯酶比活力(mmol.mg-1Pr. min-1)Table2.2 Th
38、e activity of -naphthylacetate esterase in Lydella grisescens larvae treated by 5% solution of milk and honey with Bt Cry1Ab protein in different concentrations饲喂时间（d）处理 1d 2d 3d 4d 5dCK 0.6180.084a 1.0060.057b 0.5410.105c 0.4150.178ab 0.2210.046b125 0.4610.037b 0.3290.059c 1.9090.284a 0.2460.090b 0
39、.2070.023b250 0.4350.067b 0.9650.020b 1.1430.019b 0.2740.037b 0.2850.044b500 0.4040.041b 1.2070.076a 0.7020.073c 0.5860.130a 0.3310.088a注：表中数据为平均值标准误，同一列中不同字母者为差异显著（P0.05） ，以下同；Means within the same column followed by the different letters are significantly different(P0.05) ,the same below.2.3 Cry1A
40、c 杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内乙酰胆碱酯酶活性影响2.3.1 还原型谷胱甘肽标准曲线图 2.3 还原型谷胱甘肽标准曲线Fig2.3 The standard curve of GSH2.3.2 Cry1Ac 杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内乙酰胆碱酯酶活性影响测定结果由表 2.3 可知，玉米螟厉寄蝇成虫取食三种毒蛋白浓度处理的食物后，125g/ml毒蛋白处理的乙酰胆碱酯酶活性在第 3 天突然升高，与对照差异显著， ；250g/ml 和500g/ml 处理的乙酰胆碱酯酶活性在第 4 天开始升高，与对照差异显著，其余时间与对照差异不显著。表 2.3 饲喂含 Cry1Ab 杀虫蛋白的蜂蜜牛奶液处理
41、后玉米螟厉寄蝇体内乙酰胆碱酯酶比活（mol.mg-1Pr. min-1）Table2.3 The activity of Acetylcholin esterase in Lydella grisescens larvae treated by 5% solution of milk and honey with Bt Cry1Ab protein in different concentrations饲喂时间（d）处理 1d 2d 3d 4d 5dCK 0.06010.0002b 0.09220.0113a 0.06460.0112b 0.03940.0112c 0.1750.0180a12
42、5 0.07980.0087a 0.05870.0170b 0.1550.0299a 0.09190.0310b 0.1800.0124a250 0.05040.0123b 0.08520.0139ab 0.06200.0299b 0.1100.0310b 0.1560.0087a500 0.04460.0113b 0.07710.0202ab 0.05280.0140b 0.1600.0045a 0.1650.0047a2.4 Cry1Ac 杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内谷胱甘肽-S-转移酶活性影响结果不同浓度处理 1d、2d、3d、4d、5d 后玉米螟厉寄蝇成虫体内谷胱甘肽-S- 转移酶比
43、活力见表 2.4。由表 1.9 可知，玉米螟厉寄蝇成虫取食三种浓度处理的食物后，谷胱甘肽-S-转移酶活比活力与对照相比总体差异不显著，各处理的谷胱甘肽 -S-转移酶活性与对照相近活低于对照，说明玉米螟厉寄蝇体内谷胱甘肽-S- 转移酶对 Cry1Ac 杀虫蛋白无明显的应激反应。表 2.4 饲喂含 Cry1Ab 杀虫蛋白的蜂蜜牛奶液处理后玉米螟厉寄蝇体内谷胱甘肽 -S-转移酶比活力(OD.mg-1Pr.min-1)Table2.4 The activity of Glutathione-S-tranaferase in Lydella grisescens larvae treated by 5%
44、 solution of milk and honey with Bt Cry1Ab protein in different concentrations饲喂时间（d）处理 1d 2d 3d 4d 5dCK0.01250.0013a0.01610.0033a0.01840.0023ab0.02230.0027a0.02080.0040a1250.01300.0016a0.01360.0023ab0.02460.0054a0.02460.0050a0.02030.0031a2500.01260.0022a0.01130.0014b0.01760.0047ab0.02060.0042a0.018
45、50.0024a5000.01320.0025a0.01220.0021ab0.01210.0016b0.01900.0040a0.01780.0029a2.5 Cry1Ac 杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内酸性磷酸酯酶活性影响2.5.1 对硝基苯酚标准曲线图 2.4 对硝基酚标准曲线Fig2.4 The standard curve of p-Nitrophenol2.5.2 Cry1Ac 杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内酸性磷酸酯酶活性影响结果由表 2.5 可知，取食 125g/ml 和 250g/ml 毒蛋白处理的玉米螟厉寄蝇体内酸性磷酸酯酶活性在第 3 天达到峰值，与对照相比差异显著，随后
46、活性回落到正常水平。500g/ml 毒蛋白处理的玉米螟厉寄蝇体内酸性磷酸酯酶活性与对照相比有明显差异，未出现活力突然增高的现象。这个结果说明酸性磷酸酯酶活性也对 Bt 毒蛋白有一定的应激反应，但为什么 500g/ml 毒蛋白处理的酸性磷酸酯酶活性无明显变化还需要进一步研究证实。表 2.5 饲喂含 Cry1Ab 杀虫蛋白的蜂蜜牛奶液玉米螟厉寄蝇体内酸性磷酸酯酶的比活力（mol.mg-1Pr. min-1）Table2.5 The activity of Acid phosphatase in Lydella grisescens larvae treated by 5% solution of
47、milk and honey with Bt Cry1Ab protein in different concentrations2.6 Cry1Ac 杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内碱性磷酸酯酶活性影响2.6.1 对硝基苯酚标准曲线饲喂时间（d）处理 1d 2d 3d 4d 5dCK 0.1270.008b 0.1290.010a 0.0820.018c 0.1010.024b 0.1570.005a125 0.0850.006c 0.1180.002ab 0.3480.001a 0.1560.025a 0.1850.027a250 0.1550.016a 0.0860.031bc 0.129
48、0.024b 0.1030.028b 0.0860.031b500 0.1430.017ab 0.0670.016c 0.1050.012bc 0.1350.008ab 0.1660.021a图 2.5 对硝基酚标准曲线Fig2.5 The standard curve of p-Nitrophenol2.6.2 Cry1Ac 杀虫蛋白对玉米螟厉寄蝇成虫体内碱性磷酸酯酶活性影响结果由表 2.6 可知，取食 125g/ml 和 250g/ml 毒蛋白处理的玉米螟厉寄蝇体内碱性磷酸酯酶活性在第 3 天达到峰值，与对照相比差异显著，随后活性回落到正常水平。500g/ml 毒蛋白处理的玉米螟厉寄蝇体内碱性磷酸酯酶活性与对照相比有明显差异，未出现活力突然增高的现象。表 2.6 饲喂含 Cry1Ab 杀虫蛋白的蜂蜜牛奶液玉米螟厉寄蝇碱性磷酸酯酶比活力 (mmol.min-1.mg-1)Table2.6 The activity of Alkaline Phosphatase in Lydella g
