1、答案仅供参考第二章 一、名词解释：1、DNA 变性：DNA 分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。2、DNA 复性：变性 DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。3、退火：指模板双链 DNA 经热变性，螺旋解开成单链后，通过缓慢冷却到 55左右，使引物(即具有互补碱基的 RNA 片段)与该模板 DNA 单链重新配对，形成新的双链分子的过程。4、DNA 芯片：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的 DNA 探针以显微打印的方式有序地固
2、化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为 DNA 芯片。5、基因诊断：又称 DNA 诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。6、酶活性单位：1 单位限制性内切酶（1 U）通常定义：在建议使用的 Buffer 及温度下，在 20l（50l）反应体系中反应 1 小时，使 1g 入 DNA 完全消化所需的酶量。7、星活性：在非最适的反应条件下，酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种酶切特异性降低的现象，称为星活性。8、平台效应：反应初期
3、，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期 ，这种现象称为平台效应。二、简答题1、影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？1）连接所用的目的片段的状态： 效率：粘性末端平端(100 倍)； 5，突出3，突出；平端：HaeIIIAluIHinCIISmaI2）连接温度连接效果最好在 37 ，但形成的互补不稳定;最佳连接温度：12-16 ，较好的连接效果，互补又较稳定;3）反应液中的成分： ATP：反复冻熔，ATP 活性降低，ATP 溶解度不高，连接缓冲液宜分装；单价离子：150-200mM NaCl，提高连接
4、效果； PEG：5%以下可以提高连接效率4）插入片段与载体的浓度比例 载体 DNA 与外源 DNA 的分子摩尔比通常为 13 左右，甚至 110 或更高。目的或作用：增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。6、建议放在 4 度冰箱连接两天效率更高比 14 度好2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影响？答：类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因
5、此第二活性又称为星号活性。 概括起来，诱发星活性的因素有如下几种： (1)高甘油含量(5, vv)； (2)限制性内切核酸酶用量过高(100UugDNA)； (3)低离子强度(线状质粒 DNA开环质粒 DNA11、碱裂解法提取质粒 DNA 的原理，分析影响试验结果的各种可能因素。碱裂解法原理：在碱性条件下，双连 DNA 氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌 DNA 不能复性呈不溶物而经离心除去。提取失败：1）洗去双链时，将质粒 DNA 洗去；2）破壁失败，质粒没析出；3）加剂问题电泳失败：1）电压太高 2）没加染色剂3）胶穿孔 4
6、）电泳时间过长12、电泳缓冲液使用一定时间后出现 DNA 在凝胶中跑不动现象的原因，有何解决办法？原因：电泳缓冲液的离子的富集作用；解决方法：1.更换成新配置的电泳缓冲液；2.把电泳槽中的缓冲液倒出混匀后再重新使用13、电泳的指示剂和染色剂有何区别，各自的作用是什么？指示剂一定要在电泳前加入，指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 400 组成载样缓冲液；（一般为：溴酚兰，二甲苯青）作用：预知电泳的速率及方向；使样品呈现颜色，便于加样；一些高浓度蔗糖或其它物质增加 DNA 的密度，可以防止 DNA 的扩散染色剂即可以在电泳前加入样液，又可以电泳后再对凝胶染色；（溴化已锭EB、硝酸银、Goldview
7、染料）作用：呈现出核酸电泳后的带型。14、限制性核酸内切酶的类型，基因工程常用的是哪种限制性核酸内切酶？（常用 II 型）15、结合已做的实验，分析影响酶切的因素。1）DNA 的纯度：DNA 中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA 等都会影响酶的活性。 2）DNA 的甲基化程度 ：dam 甲基化酶（修饰 GATC 中的 A） ； dcm 甲基化酶（修饰 CCA/TGG的 C） 。3）温度 ：不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是 37 oC，少数要求 40-65 oC。4）缓冲液(Buffer)：是影响限制酶活性的重要因素。 MgCl2、NaCl/KCl： 提供 Mg2+和
8、离子强度； Tris-HCl： 维持 pH； 二硫苏糖醇（DTT）： 保持酶稳定性； 牛血清白蛋白 BSA 等： 有助于酶的稳定；巯基乙醇： 保持酶的稳定性，防止酶失活16、限制性核酸内切酶命名规则及各字母代表的含义。命名规则：寄主菌属名的第 1 个字母种名的前两个字母菌株或菌型代号（大写）空白发现序列（罗马数字）例子： EcoR( E：属名； co：种名； R：株；：发现次序)17、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶
9、：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。 ）18、试分析提高平端 DNA 连接效率的可能方法。1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。3、足够多的载体和插入片段是最重要的 。4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积第三章 基因克隆载体一、名词解释：1、基因工程：在体外将外源基因进行切割并与一定的载体连接，构成重组 DNA 分子并导入相应受体细胞，使外源基因在受体细胞中进行复制、表达，使目的基因大量扩增或得到相应基因的表达产物或
10、进行定向改造生物性状。 简单概括，就是将外源目的基因与载体重组后再进入宿主细胞的过程。2、载体：能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，在基因工程重组 DNA技术中将 DNA 片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的 DNA 分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。3、转化：指将质粒或其他外源 DNA 导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。4、感染：利用噬菌体将外源 DNA 导入宿主细胞的方法。5、转导：由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。它是细菌之间传递遗传物质的方式之一。其具体含义是指一个细胞的 DNA 或 RNA 通过病毒载体的感染
11、转移到另一个细胞中。6、转染：指真核细胞主动摄取或被动导入外源 DNA 片段而获得新的表型的过程。常用的方法有电穿孔法，磷酸钙共沉淀法，脂质体融合法等。二、简答题1、YAC 载体具有什么样的功能性 DNA 序列？为什么在克隆大片段时，YAC 具有优越性？答：YAC 带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个 DNA 复制起点，两个端粒。YAC 能够容纳长达几百 kb 的外源 DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。2、列举质粒载体必须具备的 4 个基本特性。答： (1)独立复制；
12、 (2)有选择标记； (3)有独特的酶切位点； (4)能转化但不扩散。3、什么是蓝白斑筛选法？答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在 载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌 半乳糖苷酶的基因片段，携带有 lac 基因片段的 载体转入 lac 的宿主菌后，在含有 5溴4氯3引哚D半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人 lac(或 lac 基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解 X-gal 的能力，转入 lac-宿主菌后，在含有 5溴4氯3引哚D半乳糖苷 (X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。4、作为基因工程载体，其应具备哪些条件
13、？1）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） ； 2） 具有合适的筛选标记；3）具有较高的外源 DNA 的载装能力；4）具有多克隆位点（MCS） ；5） 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。5、质粒的不相容性及其分子机理。1）定义：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。2）分子机理：两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制同时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。6、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector
14、)主要包括质粒(plasmid)和病毒(virus)两大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标记基因、单一的限制酶切点等。 7、用已学过的重组体分子的选择与鉴定技术，试设计一个试验方案，假如一特异 PCR 扩出的基因或基因片断重组进 pBR322 载体并转化大肠杆菌，如何鉴定并获得真实转化子？第四章 目的基因的分离1、基因文库：将所有的重组 DNA 分子都导入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。 2、cDNA 文库：从组织细胞中分离得到纯化的 mRNA，然后以 mRNA 为模板，利用逆转录酶合成其互补 DNA，再复制成
15、双链 cDNA 片段，与适当载体连接后导入受体菌内，扩增，构建cDNA 文库。 3、RFLP：RFLP 标记是发展最早的 DNA 标记技术。RFLP 是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。 4、核酸探针：是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。 二、简答题1、什么是基因文库？用重组 DNA 技术将某种生物细胞的总 DNA 或染色体 DNA 的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增
16、殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。三、论述题1、如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因?答：可以通过合成核苷酸探针或设计简并 PCR 引物从 cDNA 文库或基因组文库中筛选。或者利用相应的抗体从 cDNA 表达文库中筛选相应的克隆。2、cDNA 克隆与基因组克隆有何不同？答：基因组克隆包含所有不在 cDNA 中出现的内含子。3、基因组文库的构建过程？如何确定文库的大小？基因组文库的构建过程：1）从生物体提取大片断的基因组 DNA；2）用适
17、当的限制性内切酶（常为 4 碱基识别位点）进行部分酶切或超声波打断基因组 DNA ；3）在琼脂凝胶电泳上或蔗糖梯度离心筛选适当长度的 DNA 片断（根据载体的要求） ； 4）载体的酶切、回收；5）将处理好的基因组 DNA 片断与载体连接；6）将重组子导入宿主细胞7）文库的鉴定、收集、保存；确定文库大小的方法：以在构建的基因组文库中任一基因存在的概率来衡量文库的质量或完备性，它与基因文库最低所含克隆数 N（即文库大小）之间的关系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中：N：文库所需的总克隆数；P：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率；f：克隆片段的平均大小/
18、 生物基因组的大小。4、基因文库的类型包括哪两种？各有什么特点？5、基因的克隆方法主要有哪些？并阐述其克隆原理。1）差减杂交（SH）通过 DNA 复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库的方式来进行目的基因分离克隆的。2）抑制性差减杂交（SSH）SSH 的核心技术是抑制性 PCR，它是一种将检测子 cDNA 单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的 cDNA 单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。3）差异显示 PCR（DD RT-PCR）利用真核生物 mRNA 结尾处有 POLY（A）结
19、构，在其 3端设计象 5-T11GA 样引物，该引物可与 mRNA 总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合 5端的随机引物（20 条 10-mer） ，可以使不同长度的基因得到扩增。4）DNA 代表性差异分析（DNA RDA）代表性差别分析是通过突变型（驱赶 DNA，driver DNA）与野生型（检测 DNA，tester DNA）基因组之间的差异来分离和鉴定突变基因的方法。5）扩增限制性片段长度多样性（AFLP）基因组 DNA 经过限制性内切酶消化后，产生粘性末端。使用人工合成的短的双链接头，该接头一端具有同样的内切酶识别粘性末端，互补连接后成为 DNA 模板。接头和与
20、接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。6）cDNA 微阵列建立一套统一且具有高质量、高代表性的 cDNA 列阵膜，在这一列阵膜上每个 cDNA 克隆都有固定的位置和编号，这样大大方便了数据的综合比较分析，并可对每个 cDNA 克隆子进行定量分析。在列阵杂交的基础上，还可以进行杂交测序，从而测定每个 cDNA 克隆子的序列。6、简单阐述差异显示 PCR 克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？主要原理：利用真核生物 mRNA 结尾处有 POLY（A）结构，在其 3端设计象 5-T11GA 样引物，该引物可与 mRNA 总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5端的随机
21、引物（20 条 10-mer） ，可以使不同长度的基因得到扩增。优点： 简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA 的组成。 所需的 mRNA 量少。 各样本 mRNA 的差异可同时进行比较。 扩出的 cDNA 可直接用于测序、文库筛选等。缺点： 假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。 工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是 3端比较短的 UTR 区的一段序列，提供的信息较少。利用该技术，目前已有越来越多的差别表达基因得以分离和鉴定，在分子生物学和基因工程研究领域发挥了极大的作用。7、差减杂交的原理与应用。原理：通过 DNA 复性动力学富集目的基因序列，并构建减数文库来克隆目的基
22、因。其本质是尽量消除两种样品共同存在的基因序列，从而有效富集目的基因序列。应用：1）基因突变体的研究：如基因的表达与不表达；2）基因时空表达的研究：如根、茎、叶；3）不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。8、基因定位克隆的原理9、酵母双杂交技术、噬菌体表面展示技术的原理。A酵母双杂交技术原理：大部分真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分隔开的结构域，一个是 DNA 特异结合域（DNA-binging domain,BD） ，一个是转录激活域(transcriptional activation domain,AD)。这两个结构域各具功能，互不影响，但一个完整的、具
23、有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成其激活功能。不同来源的激活因子的 BD 区与 AD 区结合后则能特异地激活 BD 结合基因的表达。B噬菌体表面展示技术原理：当外源 DNA 片段插入丝状噬菌体基因组的一个外被蛋白基因中时，如果两者读码框结构保持一致，这个外源 DNA 片段所编码的产物可与此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表达，并显示在噬菌体的表面。利用抗此外源基因编码产物（多肽或蛋白）的抗体，通过亲和纯化，就能从大量的噬菌体中富集、分离出含有所要的基因的融合噬菌体。然后，通过基因扩增，得到大量所要的目的基因。10、T-DNA 标签法克隆基因的一般技术路线。 农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。 建立突变体基因组文库及野生型基因组文库. 用 T-DNA 片段做 probe 筛选突变体文库，获得阳性克隆。 用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。 把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。11、常用的目的基因的获取方法有哪些？ 答： 1 直接分离法；2 构建基因组文库分离法；3 cDNA 基因文库的构建及目的基因分离；4 利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因 ；5 基因的化学合成。
