1、第二章 分子克隆工具酶基因工程工具酶 限制性内切酶主要用于 DNA 分子的特异切割 DNA 甲基化酶用于 DNA 分子的甲基化 核酸酶用于 DNA 和 RNA 的非特异性切割 核酸聚合酶用于 DNA 和 RNA 的合成 核酸连接酶用于 DNA 和 RNA 的连接 核酸末端修饰酶用于 DNA 和 RNA 的末端修饰 其它酶类用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。第一节 限制性核酸内切酶(restriction enzyme)一、限制性内切酶的发现历史核酸酶：催化核酸酯键的水解核酸外切酶：作用于核酸链的末端(3或 5 ), 逐个水解核苷酸。核酸内切酶：从核酸分子内部切断 3， 5磷酸二酯键。
2、限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链 DNA 的核酸内切酶。1、细菌的限制修饰现象细菌的限制修饰作用发现细菌的限制（restriction）现象：寄主控制的专一性phageK R-M 系统的作用:R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。 保护自身的 DNA 不受制；破坏外源 DNA 使之迅速降解细菌 R-M 系统的限制酶可以降解 DNA，为避免自身 DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身 DNA，未被修饰的外来 DNA 则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源 DNA 的一类酶，其功能是避免外源
3、 DNA 的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于 R/M 现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。2、限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶(restriction endonuelease) 是一类能识别双链 DNA 中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。它是可以将外来的 DNA 切断，即能够限制异源 DNA 的侵入并使之失去活力，但对自己的 DNA 却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在 DNA 分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。 1968 Linn
4、 和 Arber 从 E.coli B 中发现限制酶 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans 因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金 。 限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列，并对 DNA 分子进行切割的一种酶。 功能：降解不同源 DNA，而不降解同源 DNA。3 、限制性核酸内切酶的命名若种名头 2 个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。 限制酶的命名是根据细菌种类而定，以 EcoRI 为例： E Escherichia （属）co coli
5、（种）R RY13 （品系）I 首先发现 在此类细菌中发现的顺序4、限制与修饰系统的种类特性 型 型 型限制和修饰活性 双功能 单一功能 双功能识别与切割位点分别，随机切割，相距较远同一位点 相距 5-10 bp对基因工程中意义 无用 非常有用 意义不大型限制酶（无用）1968 年，M.Meselson 和 R.Yuan 在 E.coliB 和 E.coliK 中分离出的核酸内切酶。 分子量：30 万 dal 左右 组成：3 种亚基a. 特异性亚基：具特异性识别 DNA 序列的特性。b. 修饰亚基：具甲基化酶活性。c. 限制亚基：具核酸内切酶活性。 辅助因子：需 Mg2+、ATP 和 SAM。
6、 识别和切割位点：不一致（距识别位点 5一侧数千碱基处随机切割 DNA 分子） 。型限制酶（十分有用）1970 年，H.O.Smith 和 K.W.Wilcox 在流感嗜血 Rd 株中分离出来的限制酶。 分子量：2 万10 万 dal（较小） 组成：一种多肽，常以同源二聚体形式存在。 辅助因子：无需辅助因子，或只需 Mg2+。 识别和切割位点：相一致。型限制酶（无用） 组成：两个亚基a. M 亚基：负责位点的识别与修饰。b. R 亚基：具核酸酶的活性。 辅助因子：需 Mg2+、ATP 和 SAM 识别和切割位点：不一致（距识别位点一侧约 25bp 处切割 DNA 分子） 。二、限制性核酸内切酶
7、识别的序列绝大多数的型限制性核酸内切酶都能够识别由 4-8 个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割 DNA 分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。 在 DNA 分子双链的特异性识别序列部位，切割 DNA 分子，产生链的断裂。 2 个单链断裂部位在 DNA 分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的 DNA 片段，具有互补的单链延伸末端。1、限制酶识别序列的长度 （限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基）4 个碱基识别位点：Sau3A GATC5 个碱基识别位点：EcoR CCWGGNci CCSGG6 个碱
8、基识别位点：EcoR GAATTCHind AAGCTT7 个碱基识别位点：BbvC CCTCAGC PpuM RGGWCCY8 个碱基识别位点：Not GCGGCCGCSfi GGCCNNNNNGGCC当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096） 。 限制性内切核酸酶2、限制酶识别序列的结构 II 型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链 DNA 分子中 4 - 8 对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。类酶识别序列特点
9、回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口3、限制酶切割的位置 DNA 在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点，用或表示。 切割的位点：一般在识别序列内部，如 GGATCC 、AT CGAT、GTCGAC、CCGCGG、AGCGCT 等。少数在识别序列的两侧，如GATC 、CATG 、 CCAGG 等 三、限制酶产生的末端1、限制酶产生匹配粘端若在对称轴 5侧切割底物， DNA 双链交错断开产生 5突出粘性末端。 5GAATTC3 EcoRl 5G OH PAATTC 3 3CTTAAG 5 3CTTAAP + OHG 5 若在 3-侧
10、切割，则产生 3 突出粘性末端，如 Pst： 5CTGCAG3 Pstl 5CTGCA- 3 5G3 3GACGTC- 5 3 G- 5 十 3-ACGT 5 2、限制酶产生平末端在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端，如 Hae（GG CC）和 EcoRV（GATATC） 。 3、限制酶产生非对称突出末端许多限制酶切割 DNA 产生非对称突出末端。当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的，如 Bbc,它的识别切割位点如：CCTCAGCGGAGT CG1. S1 核酸酶(1) 特点：活性：降解单链核酸（DNA 或 RNA）为单核苷酸；降解双链核酸的单链区(2
11、) S1 核酸酶的应用-RNA 分子的定位2. Bal31 核酸酶Bal31 核酸酶的三种活性：（1）单链核酸内切（2）双链核酸外切（3）双链切口对应链Bal31 核酸酶主要用途：（1）诱发 DNA 发生缺失突变（2）定位测定 DNA 片断中限制性位点的分布（3）研究超盘旋 DNA 分子的二级结构3. 其他核酸酶外切核酸酶（Exonuclease ）：3至5外切RNA 酶(RNase)：切割 DNA-RNA 杂合链中的 RNA其他核酸酶:外切核酸酶（Exonuclease ）：3至5外切DNA 酶（DNase ）：随机切割 ss 吸能反应。DNA 连接酶是一种封闭 DNA 链上缺口酶，借助 A
12、TP(动物与噬菌体 )或 NAD (细菌) 水解提供的能量催化 DNA 链的5-PO4 与另一 DNA 链的 3-OH 生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA 连接酶除外)，而且必须是两条紧邻 DNA 链才能被 DNA 连接酶催化成磷酸二酯键。 DNA 连接酶的连接机制:DNA 连接酶利用 NAD 或 ATP 中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。反应过程可分三步： (1)NAD+或 ATP 将其腺苷酰基转移到 DNA 连接酶的一个赖氨酸残基的 氨基上形成共价的酶- 腺苷酸中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸。 (2)将酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰
13、基再转移到 DNA 的 5-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即 DNA-腺苷酸; (3)这个被激活的 5-磷酰基端可以和 DNA 的 3-OH 端反应合成磷酸二酯键，同时释放出 AMP。 连接酶的作用机理此反应是由焦磷酸 (ppi)的水解作用激发的,需要花费两个高能磷酸键,DNA 连接酶所催化的整个过程是可逆的。酶-腺苷酸中间物可以与 NMN 或 PPi 反应生成 NDA 或 ATP 及游离酶;DNA- 腺苷酸也可以和 NMN 及游离酶作用重新生成 NAD。该逆反应过程可以在 AMP 存在的情况下使共价闭环超螺旋 DNA 被连接酶催化，产生有缺口的 DNA-腺苷酸，生成松弛的闭环 DNA。 D
14、NA 连接酶的基本性质(1) 修复双链 DNA 上缺口处的磷酸二酯键(2) 修复与 RNA 链结合的 DNA 链上缺口处的磷酸二酯键(3) 连接多个平头双链 DNA 分子二、DNA 连接酶（ligase）种类 T4DNA 连接酶 大肠杆菌 DNA 连接酶 T4DNA 连接酶 可连接带匹配粘性末端的 DNA 分子，也可使平端的双链 DNA 分子相互连接。反应底物为黏端、切口、平末端的 RNA（效率低）或 DNA。反应系统中必须加有辅助因子 ATP (a)分子间连接 (b)分子内连接二、DNA 连接酶（ligase）( 大肠杆菌 DNA 连接酶 )只能连接带匹配粘末端的 DNA 分子,反应系统中必
15、须含 NAD 作为辅助因子。三、T4 多核苷酸激酶和碱性磷酸酶磷酸激酶催化 5加 P （标记） 碱性磷酸酶去除 5- P （防止自身环化） T4 多核苷酸激酶（标记） 在分子克隆中呈两种反应，其一是正反应，指将 ATP 的 磷酸基团转移至无磷酸的 DNA5末端，用于对缺乏5磷酸的 DNA 进行磷酸化。其二是交换反应，在过量 ATP 存在的情况下，该酶可将 DNA 的 5端磷酸转移给 ADP，然后 DNA 从 ATP 中获得 磷酸而重新磷酸化。 碱性磷酸酶（防止自身环化） 来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）;来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP ）五、核酸酶（nuclease）Bal 31
16、核酸酶 单链内切双链外切的核酸酶 来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana） 从 DNA 末端同时降解两条链。 用于基因表达调控序列的研究。S1 核酸酶 降解单链核酸 来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae） 用于把具粘性末端的 DNA 变为平齐末端的 DNA。 在 DNA 部分变性条件下，能在富含 AT 区切断 DNA。 S1 核酸酶 S1 核酸酶来源于稻谷曲霉(Aspergillusoryzae)，是一种高度单链特异的核酸内切酶，在最适的酶催反应条件下，降解单链 DNA 或 RNA，产生带 5，-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。对双链 DNA、双链 RNA 和DNA-RNA 杂交
17、体相对不敏感。通常水解单链 DNA 的速率要比水解双链 DNA 快 75000 倍。这种酶需要低水平的 zn2+的激活，最适 pH 范围为 4043。 一些螯合剂(如 EDTA 和柠檬酸等 )能强烈地抑制 s1 核酸酶活性，此外磷酸缓冲液和 06左右的 SDS 溶液也可以抑制它的活性，但它对尿素以及甲酰胺等试剂则是稳定的。S1 核酸酶的单链水解功能可以作用于双链核酸分子的单链区，并从单链部位切断核酸分子，而且这种单链区可以小到只有一个碱基对的程度。由于具备这种功能，使 S1 核酸酶在分析核酸杂交分子(RNA-DNA)的结构、给 RNA 分子定位、测定真核基因中间隔子序列的位置、去除 DNA 片
18、段中突出的单链尾，以及打开在双链 cDNA 合成期间形成的发夹环。 六、核酶（ribozyme） 1981 Cech 和 Altman 首次发现，并因此获得 1989 年的诺贝尔奖。 具有酶活性的 RNA 片段。 是真核生物转录产物地内含子本身含有的前导序列，能在离体条件下特异地催化内含子剪切。 核酶可以作为 RNA 的限制性内切酶用于基因操作。重组 DNA 技术中常用的工具酶 1工 具 酶 功 能限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割 DNADNA 连接酶 催化 DNA 中相邻的 5磷酸基和 3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使 DNA 切口封合或使两个 DNA 分子或片段连接DNA 聚合酶 合成
19、双链 cDNA 分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA 序列分析 填补 3末端重组 DNA 技术中常用的工具酶 2工 具 酶 功 能Klenow 片段 又名 DNA 聚合酶 I 大片段，具有完整 DNA 聚合酶 I 的 53聚合、3 5外切活性，而无 53外切活性。常用于 cDNA 第二链合成，双链 DNA 3末端标记等反转录酶 合成 cDNA 替代 DNA 聚合酶 I 进行填补，标记或 DNA 序列分析重组 DNA 技术中常用的工具酶 3工 具 酶 功 能多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶 在 3羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
20、（一）思考与探究1.限制酶在 DNA 的任何部位都能将 DNA 切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的 DNA 片段： (1) CTGCA (2) AC (3) GCG TG CG（4） G (5) G (6) GCCTTAA ACGTC CG(7) GT (8)AATTCCA G你是否能用 DNA 连接酶将它们连接起来？ 答：2 和 7 能连接形成ACGTTGCA；4 和 8 能连接形成GAATTCCTTAAG；3 和 6 能连接形成GCGCCGCG；1 和 5 能连接形成CTGCAGGACGTC。2.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的 DNA？提示：迄今为止，基因
21、工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断 DNA 上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身 DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的 DNA 可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其 DNA 分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的 DNA 被切断，并且可以防止外源DNA 的入侵。3.网上查询：DNA 连接酶有连接单链 DNA 的本领吗？ 提示：迄今为止，所发现的 DNA 连接酶都不具有连接单链 DNA 的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链 DNA 的酶。4. DNA 连接酶与 DNA 聚合酶是一回事吗？为什么？ 答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为 Ecoli 连接酶。另一种是从 T4 噬菌体中分离得到，称为 T4 连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链 DNA 的缺口（nick） ，而不能连接单链 DNA。DNA 连接酶和DNA 聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的 3 位碳原子上的羟基与 5 位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成） 。
