1、Chapter 7 色谱技术 Chromatography,Knowledge Points,The definition of chromatographic technology色谱分离技术 The classification of chromatographic technology色谱分离技术的分类The definition of theoretical plate number and its calculation色谱柱的理论塔板数和计算？ Adsorption chromatography, classification and its basic mechanism吸附色谱
2、及其分类和基本原理 Partition chromatography分配色谱 The classification of ion exchange chromatography and its application离子交换色谱的分类及应用 The separation mechanism of gel chromatography and its classification凝胶色谱的分离原理及分类 The mechanism of ion exchange and Hydrophobic Interaction Chromatography离子交换及疏水作用层析的原理 The separa
3、tion mechanism of HPLC and its applications 高效液相色谱的分离原理及应用 The normal chromatograph methods on proteins isolation蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？,色谱现象,A、图形包含的意义 B、分离机制 C、柱效 D、分离度,纸层析,In 1903，俄国植物学家Michael Tsweetts Work(see Ber. Deut. Botan. Ges., 1906; 24: 384). Chromatography = (chromatus = color, graphein = to wr
4、ite).,色谱技术（分配色谱）,概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（stationary phase,多孔介质）和流动相(mobile phase)，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。,色谱分离方法的分类,色谱分离方法：按照固定相基质的形式分：纸色谱、薄层色谱和柱色谱；按照两相所处的状态分：气相色谱（气液色谱，气固色谱）和液相色谱（液液色谱、液固色谱） 但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有： 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱（上章讲过） 凝胶色谱 亲和色谱（上章讲过）,色谱系统的
5、基本组成,色谱分离的基本概念,分配系数：指在一定条件下，某种组分在固定相和 流动相中含量的比值。 可由Langmuir方程得出Kd-分配系数 q、c-溶质在固相和液相中的浓度,保留时间（tR）和保留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一,阻滞因子Rf，又称迁移率或比移值 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积Vm流动相的平均截面积*色谱柱长，Vs固定相的平均截面积*色谱柱长，Kd分配系数
6、 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异,色谱柱的理论塔板数、塔板高度 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法：N-理论塔板数 tR-保留时间 W1/2-半峰宽 Wb-峰底宽度 理论塔板高度：L-柱长,例1 已知某组分峰的峰底宽为40S，保留时间为400S，计算此色谱柱的理论塔板数。例2 已知一根1米长的色谱柱的有效塔板数为1600块，组份A在该柱上的调整保留时间为100秒，试求A峰的半峰宽及有效塔塔板高度。,吸附色谱,原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力）以及氢键的差异而实现分离 关键要素：
7、吸附剂和展开剂的选择 吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2,Adsorption chromatography,常用的吸附剂： 氧化铝 硅胶 活性炭 纤维素 聚酰胺 硅藻土,展开剂的选择,展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大 因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果 展开剂选择的原则： （1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小 （2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力,常用展开剂的洗脱能力及极性比较,水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷
8、四氯化碳环己烷石油醚,一般吸附色谱的操作程序,根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相 吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数 洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物,分配色谱,原理：利用溶质在固定相（液体）和流动相（液体）之间的分配系数不同而分离的方法 要素：固定相、载体、流动相,载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体 载体种类： 硅胶 硅藻土 纤维素 葡聚糖凝胶,固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相 详见P193 流动相可以是极性的（反相色谱法）
9、，也可以是非极性的（正相色谱）*反相色谱固定相是非极性的, 流动相是极性的,HPLC,HPLC Chromatogram,肉碱,完整不？,反相液相色谱,反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求 通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性,载体：微粒多孔硅胶（粒径5m20 m ）Hypersil（Thermo公司）、Sepherosil XOB075 固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质C18适于分离核酸 流动相的选择通常采用有机溶剂，乙腈、甲醇、异丙醇、正丙
10、醇和四氢呋喃,Source RPC,Influence of Particle Size on the Separation effect,离子交换色谱,以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法,常用的离子交换树脂,葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25 纤维素系列离子交换剂DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fa
11、st FlowBio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂,Source 系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低阳离子交换树脂 S系列阴离子交换树脂 Q系列 MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相 同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同样分为Q系列和P系列,Expanded Bed,分子筛凝胶色谱,在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离 优点：操作简便分离效果好，重复性高，回收率高分离条件温和应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐分辨率低,分子筛凝胶色谱原理,De
12、salting proteins,proteins,salts,疏水作用层析 (Hydrophobic Interaction Chromatography）,Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity,Mechanism of HIC,Na2SO4 1.0 M,疏水层析操作,凝胶色谱填料,葡聚糖凝胶 Sephadex G-系列 聚丙烯酰胺凝胶Sephacryl系列
13、 琼脂糖凝胶 Sepharose系列 Superose系列,亲和色谱（Affinity chromatography）,Four steps: 载体活化、配基连接、吸附、洗脱,Competitive elution,蛋白质分离常用的色谱方法,免疫亲和层析属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离免疫亲和层析介质的获得：（1）获得抗体（2）抗体连接到载体上,疏水层析在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。 操作要点蛋白质的局部变性洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行,离子交换色谱是
14、最常用的蛋白质分离手段操作要点： 由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定 由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂 适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点） 缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在1020m mol 层析方案的确定，需要视试验情况作适当调整 洗脱方式：pH梯度离子强度梯度,AIEX,Technique,Purification factor,Q Sepharose FF,10 times purification82%
15、yield,Phenyl Sepharose HP,HIC,Y.-F. Liao et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 28348,Purification of recombinant a-mannosidase from Pichia pastoris,KTA explorer 100色谱系统,KTAexplorer作为蛋白纯化的工具已经被广泛运用，但是对于初次接触的新手来说，庞大的体积和复杂的管路绝对是一种挑战。,KTA explorer 100色谱系统工作流程,纸层析,是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析 介
16、质：滤纸 操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹,展开剂的选择,展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂 常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂为：正丁醇-甲酸-水（15：3：2） 展开方式： 上行色谱 下行色谱 径向色谱,薄层色谱法,将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法 常用的固定相有：硅胶和氧化铝 优点： 设备简单、操作方便 快速 显色方式多，如可以选用浓硫酸等进行显色 灵敏度高（较纸层析） 可以大量制备,多肽的分离纯化,G Protein Receptor Kinase Purification,Rec a-Mannosidase Purification from Pichia,DNA Binding Protein Purification,本章作业,课后习题1 P281 色谱方法共分几类？常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述其原理 何为理论塔板高度和理论塔板数？如何计算？ 简述高效反相液相色谱的工作原理？ 简述HIC的工作原理？ 简述凝胶色谱的工作原理？,
