1、1备 课 教 案学年学期：2011-2012 秋季学期课程名称：基因克隆主讲教师：李海英授课对象：2009 级生命科学学院本科黑 龙 江 大 学2第 1 教学周/第 3.4.5 节 （第 1 次课）教 学 基 本 内 容 备注教学目的：通过本章的学习，使学生掌握基因克隆、重组DNA 等相关概念，同时介绍基因工程的发展简史和基因工程的巨大意义，引导学生对科学的严谨、谦虚态度。教 具：多媒体课件教学重点：DNA 嵌合体概念课时安排：3 学时教学难点：基因克隆与基因表达的技术路线的区别教学内容： 第一章 绪论一、基因工程的概念1. 基因工程（genetic engineering） 、遗传工程、重组
2、体DNA 技术2. 嵌合 DNA、DNA 嵌合体（DNA chimera)3. 分子克隆（molecular cloning)、基因克隆 (gene cloning)、重组 DNA (recombinant DNA)4. 基因工程的操作步骤（1）基因克隆的操作步骤（2）基因表达的操作步骤二、基因工程发展简史三、基因工程的巨大意义1. 利用微生物制药（1）利用微生物生产胰岛素（2）重组微生物生产生长激素（3）重组微生物生产干扰素2. 克隆技术（clone technology）（1）克隆的概念（2）器官移植1、启发式教学内容：启发学生的学习科学和实验操作的态度。2、互动教学内容：课堂讨论克隆的伦
3、理道德问题。3（3）干细胞研究及人类伦理观念3. 基因工程育种（1）基因改造的农作物（2）转基因动物四、基因工程的安全性问题复习题1、基因克隆与基因表达技术路线的区别。 2、收集整理有关转基因植物、转基因动物的报道和照片资料。3、启发式教学内容通过对转基因植物和转基因动物的介绍，激发学生的学习兴趣。4第 2 教学周/第 3.4.5 节 （第 2 次课）教 学 基 本 内 容 备注教学目的：本节主要讲述有关“限制性核酸内切酶”的相关知识，通过对大肠杆菌限制-修饰现象的讲解，引导学生探究宿主控制性限制的生物学机理；掌握各类限制性核酸内切酶的生物学功能和命名原则。教 具：多媒体课件教学重点：型限制性
4、核酸内切酶的特点和限制性核酸内切酶生物学功能的英文表述。课时安排：3 学时教学难点：限制-修饰现象的理解教学内容：第二章 基因工程的工具酶第一节 限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶的发现1. 发现过程2. 相关概念（1）限制 (restriction)（2）修饰 (modification)（3）宿主控制性限制(hostcontrolled restriction)3. 限制性核酸内切酶的生物学功能Restriction-modification systems occur in many bacterial species, and constitute a defense mechani
5、sm against the introduction of foreign DNA into the cell. They consist of two components; the first is a restriction endonuclease, which recognizes a short, symmetrical DNA sequence, and cuts (hydrolyzes) the DNA backbone in each strand at a specific site within that sequence. Foreign DNA will hence
6、 be degraded to 1、课前提问（1）DNA 嵌合体概念（2）基因克隆的操作步骤（3）基因表达的操作步骤2、通过对大肠杆菌限制-修饰现象的描述，引导学生探究其中的原因。3、利用对 Smith 和Nathans 获得 1978 年诺贝尔生物医学奖的介绍，激励学生探索生命的奥秘。 5relatively short fragments. The second component of the system is a methylase, which adds a methyl group to a C or A base within the same recognition sequ
7、ences in the cellular DNA. This modification renders the host DNA resistant to degradation by the endonuclease.二、限制性核酸内切酶的分类1. 型限制性核酸内切酶2. 型限制性核酸内切酶（1）一般性质（2）型酶的识别序列与切割作用A. 识别序列B. 平末端（blunt/flush end/termini)C. 粘性末端（sticky/cohesive end/termini)（3）型限制性内切酶的特点（4）酶切位点的计算3. III 型限制性内切酶三、限制性核酸内切酶的命名复习题一、填
8、空题1、完全的回文序列具有两个基本的特点，分别是（ ）和（ ） 。2、由于 DNA 是由 4 种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是（ ） 。3、第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是（ ） 。4、核酸内切酶命名原则是，第一个大写字母取自（ ） ，第二、三两个字母取自（ ） ，第四个字母则用（ ）表示。4、注意区别粘性末端和平末端、同裂酶和同尾酶两对概念。6二、简答题下面几种序列中，那些最有可能是类酶的识别序列，为什么？ GAATCG，AAATTT，GATATC，ACGGCA7第 3 教学周/第 3.4.5 节 （第 3 次课）教 学 基 本 内 容 备注教学目的：通
9、过本章的学习，使学生掌握天然 DNA 的制备、纯化和浓缩以及限制性内切酶反应系统的建立，本章重点内容是影响限制性核酸内切酶活性的各种因素，并要求学生掌握限制性核酸内切酶的星活性、限制性图谱等概念。教 具：多媒体课件、教具教学重点：影响核酸内切限制酶活性的因素课时安排：3 学时教学难点：DNA 分子的限制性图谱的构建教学内容： 第二章 基因工程的工具酶 第二节 DNA 分子片段化一、天然 DNA 的制备 1. 天然 DNA 的来源2. 天然 DNA 的提取 二、DNA 的纯化 三、DNA 的浓缩 四、限制性核酸内切酶反应系统 1. 限制性核酸内切酶反应缓冲液 2. 单酶切法 3. 双酶切法 4.
10、 部分酶切5. DNA 分子的限制性图谱五 、影响核酸内切限制酶活性的因素1. 性活性1、 课前提问型限制性核酸内切酶的特点。2、互动教学内容：让学生总结 DNA 的制备、DNA 的纯化和DNA 的浓缩三个概念的区别，引导学生利用比较的方法学习知识。82. DNA 样品的纯度3. DNA 甲基化的程度4. DNA 的分子结构5. 侧翼序列长度6. 酶切反应缓冲液7. 酶切反应温度和时间复习题1. 什么是限制性内切酶的星活性？受哪些因素影响？2. 分别用 EcoR、Hpa、EcoR +Hpa酶切一个DNA 片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离 DNA 片段，溴化乙锭染色后观察 DNA 带型（如下
11、图） ，请根据这些结果，绘制一个限制性图谱，要标明 EcoR和 Hpa识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（kb） 。并请写出分析的过程9第 4 教学周/第 3.4.5 节 （第 4 次课）教 学 基 本 内 容 备注教学目的：通过本章的学习，使学生掌握 DNA 聚合酶概念、分类、各种 DNA 聚合酶的性质和用途，以及对一些专业名词的正确理解，如间断、缺刻等。教 具：多媒体课件教学重点：各种 DNA 聚合酶的性质和用途课时安排：3 学时教学难点：用切口平移（缺口转移）方法标记 DNA 以及一些专业名词的正确理解。教学内容： 第二章 基因工程的工具酶第三节 DNA 聚合酶 一、DNA 聚合酶
12、概述1. DNA 聚合酶（polymerase）的概念 2. DNA 聚合酶的分类（1）以 DNA 聚合酶 I 为代表的“合成型” ；（2）以 klenow 聚合酶为代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性；（3）逆转录酶类，以 RNA 作为聚合模板。二、大肠杆菌 DNA 聚合酶 I（全酶）1. 性质2. 用途：用切口平移（缺口转移）方法标记 DNA三、大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 大片段（Klenow 片段）1. 性质2. 用途1、课前提问：（1）影响限制性核酸内切酶活性的因素有哪些？（2）双酶切时有哪些是需要主义的问题？2、 启发式教学内容：（1）启发学生比较间断（discontinuity
13、）和缺刻（nick）两个概念。（2）引导学生比较三类 DNA 聚合酶在作用方式上的差别。3、课堂活动内容：大肠杆菌 DNA 聚合酶I 同时具有 53方向的聚合酶活性和35核酸外切酶活10四、T4 噬菌体 DNA 聚合酶1. 性质2. 用途五、T7 噬菌体 DNA 聚合酶1. 性质2. 主要用途六、Taq DNA 聚合酶1. 性质2. 用途：用于 PCR 反应，使得 PCR 技术得以推广。七、逆转录酶（reverse transcriptase）（依赖于 RNA的 DNA 聚合酶）1. 性质2. 用途复习题一、填空1. T4 DNA 聚合酶与 Klenow 酶一样，具有 53 聚合酶和 3 5外
14、切酶两种活性，但它的 35外切酶活性比Klenow 酶强（ ）倍，T4 DNA 聚合酶作用于（ ）链的活性要强于（ ）链。2. 反转录酶除了催化 DNA 的合成外，还具有（ ）的作用，可以将 DNA -RNA 杂种双链中的（ ）水解掉。二、判断题1. 反转录酶能够以单链 RNA 或 DNA 为模板，在引物的引发下合成一条互补的 DNA 链。2. 以 RNA 为模板，用反转录酶可同时产生单链和双链的 cDNA，双链 DNA 是由自身引物引导合成。三、问答题如何利用 T4 NA 聚合酶制备 3隐含末端或双链平末端？性，这意味着即使53方向的聚合酶活性新合成了 DNA 分子也会立即被其同时具有的 3
15、5核酸外切酶活性所降解。真实情况是这样的吗？4、课堂互动内容自 1983 年 PCR 技术问世年到发明人 Dr. Kary Mullis 1993 年获得诺贝尔化学奖经历了 10 年的时间，那么一项技术得到广泛应用、认同需要什么？11第 5 教学周/第 3.4.5 节 （第 5 次课）教 学 基 本 内 容 备注教学目的：通过对本次课的学习，重点使学生掌握锚定PCR、不对称 PCR 和反向 PCR 三种特殊的聚合酶链式反应以及一种分子标记技术RAPD。教 具：多媒体课件教学重点：三种特殊的聚合酶链式反应的原理课时安排：3 学时教学难点：RAPD 技术的基本原理教学内容：第二章 基因工程的工具酶
16、第四节 聚合酶链式反应及应用一、锚定 PCR1. 已知序列 3端区域的扩增2. 已知序列 5端区域的扩增 二、不对称 PCR三、反向 PCR 第五节 RAPD 技术一、多态性（polymorphism)1. 多态性/差异性的概念2. 多态性的种类3. 多态性产生的过程4. 多态性的相关技术二、RAPD 基本原理1、课前提问：（1）缺刻（nick）和间断（discontinuity）两个概念。（2）比较各种 DNA聚合酶的活性用什么不同之处。互动内容：提问常规 PCR 的原理，引导学生思考如果目的片段两侧的序列未知，而是只知道目的片段中间的一部分的序列信息，用什么方法可以获得目的片段？12三、技
17、术问题1. 引物 2. Mg2+浓度要求四、RAPD 技术的应用1. 遗传指纹作图 2. 检测遗传多样性与稳定性复习题1. 生么情况下可以考虑使用不对称 PCR?2. 反向 PCR 的原理？3. RACE 技术的原理？13第 6 教学周/第 3.4.5 节 （第 6 次课）教 学 基 本 内 容 备注教学目的：通过对本次课的学习，重点使学生掌握 DNA 连接酶相关知识，如 DNA 连接酶的特性、粘性末端连接技术、连接反应的建立等。教 具：多媒体课件教学重点：DNA 连接酶的功能和粘性末端连接技术课时安排：3 学时教学难点：粘性末端连接技术教学内容：第二章 基因工程的工具酶第六节 DNA 连接酶
18、（ligase） 一、连接酶反应1. 间断修复功能2. 连接功能二、常用的 DNA 连接酶1. E. coli DNA 连接酶 2. T4 DNA 连接酶T4 DNA ligase repairs breaks in a dsDNA backbone and can covalently rejoin annealed cohesive ends in the reverse of a restriction enzyme reaction, to create new DNA molecules.T4 ligase can even ligate one blunt end to anoth
19、er, albeit with rather lower efficiency.3. RNA 连接酶课前提问：1、反向 PCR？2、RAPD 的原理？课堂互动内容1. 启发学生思考 DNA连接酶和 DNA 聚合酶的功能差别。2. 为什么在基因克隆中连接酶是另一个重要的工具酶？3. 为什么粘性末端要比平末端的连接效率要高？14三、粘性末端连接技术1、衔接体(linker) 技术2、结合体(adaptor)技术3、同聚体(homopolymer) 加尾技术第七节 结合体技术的应用 AFLP一、概述二、基本原理AFLP technology is based on the selective amp
20、lification of genomic restriction fragment using PCR. DNA is digested with restriction endonucleases, and double-stranded DNA adapters are ligated to the ends of the DNA fragments to generate template DNA for amplification. Thus, the sequence of the adapers and the adjacent restriction site serve as
21、 primer binding sites for subsequent amplification of the restricton fragments by PCR. Selective nucleotides extending into the restriction fragments are added to the 3 ends of the PCR primers such that only restriction fragments in which the nucleotide flanking the restriction site match the select
22、ive nucleotide will be amplified. The amplified fragments are then analyzed by gel electrophoresis to generate the fingerprint.三、技术特点四、主要应用复习题（填空题）（1）为了防止 DNA 的自身环化，可用（ ）脱去双链 DNA( )。（2）欲将某一具有突出单链末段的双链 DNA 分子转变成平末段的双链形式，统常可采用（ ）和（ ）的作用。课堂互动内容：粘性末端的连接效率远远高于平末端的连接，但在基因工程操作中得到的片段往往都是平末端的，同学们能否想出一些办法，将本是
23、平末端的连接转变成粘性末端的连接呢？152、判断题（1）T4 DNA 连接酶和 E.coli 连接酶都能催化平末端和粘性末端的连接。（2） T4 DNA 连接酶和 E.coli 连接酶都能催化双链DNA 和单链 DNA 连接。第 7 教学周/第 1.2.3 节 （第 7 次课）教 学 基 本 内 容 备注教学目的：本节课主要讲述核酸修饰酶（如未端转移酶、碱性磷酸酶、多核苷酸激酶等） 、单链核酸内切酶（如 S1核酸酶和 Bal 31 核酸酶等）以及核酸外切酶等基因工程常用酶，使学生掌握这些酶的生物学活性，明确这些酶在基因工程中的应用。教 具：多媒体课件教学重点：核酸修饰酶和单链核酸内切酶生物学活
24、性课时安排：3 学时教学难点：核酸修饰酶的应用教学内容：第八节 基因工程的其它酶类一、核酸修饰酶1. 未端（脱氧核苷酸）转移酶 2. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）3. 多核苷酸激酶(polynucleotide kinase)二、单链核酸内切酶1. S1 核酸酶2. Bal 31 核酸酶三、核酸外切酶(exonucleases)1. 核酸外切酶 VII(exoVII) 2. 核酸外切酶 III (exoIII)课前提问：1、AFLP 技术的英文表述？2、衔接体(linker)、结合体(adaptor)、同聚体(homopolymer)加尾等技术。课堂互动内容在基因操作
25、中，常常会遇到不希望发生连接作用的互补粘性末端末端发生了自连作用，引导学生思考怎样才能避免这种情况的发生？163. 核酸外切酶(exo) 4. T7 基因 6 核酸外切酶复习题1. 欲将某一具有突出单链末段的双链 DNA 分子转变成平末段的双链形式，统常可采用（ ）和（ ）的作用。2. 为了防止 DNA 的自身环化，可用（ ）脱去双链 DNA( )。3.、简答题按适当的顺序，列出将一种 mRNA 的 cDNA 克隆到表达载体所用到的酶。17第 8 教学周/第 3.4.5 节 （第 8 次课）教 学 基 本 内 容 备注教学目的：本章首先基因克隆技术做了概述讲述了基因工程载体的基本概念和载体的种
26、类、性质。着重介绍了质粒载体的概念、生物学特性、质粒的遗传与复制、构建质粒克隆载体的基本策略。教 具：多媒体课件教学重点：质粒的生物学特性课时安排：3 学时教学难点：构建质粒克隆载体的基本策略教学内容：第三章 基因工程载体第一节 基因克隆技术概述一、基因克隆技术二、目的基因的取得三、重组体的构建1. 载体的概念2. 载体的性质四、转化及重组子筛选鉴定1. 转化（transformation)2. 重组子课前提问：采取什么措施可以防止接头发生自连作用？课堂互动内容：基因工程操作为什么要用到载体？课堂互动内容：转化子与重组子的区别？183. 重组子的筛选方法第二节 质粒载体（Plasmid Vec
27、tor ）一、质粒的概念二、质粒的一般生物学特性1. 质粒 DNA（1）SC 构型（2）OC 构型（3）L 型2. 质粒的复制与遗传3. 构建质粒克隆载体的基本策略 4. 质粒的改造复习题 1、基因克隆技术的一般过程？2、在琼脂糖凝胶电泳中，质粒 DNA 的 SC 型、OC 型和 L 型是如何分布的？3、质粒载体必须具备的 4 个特性？4、构建质粒克隆载体的基本策略？课堂互动内容：质粒 DNA 在琼脂糖凝胶上会呈现出几条带？为什么？19第 9 教学周/第 3.4.5 节 （第 9 次课）教 学 基 本 内 容 备注教学目的：本章主要讲述 pBR322 质粒载体、pUC 质粒载体、TA 克隆载体
28、和酵母中的质粒载体等内容。要求学生重点掌握 pBR322 质粒载体的构建、pUC 质粒载体的结构和TA 克隆载体的构建等内容。教 具：多媒体课件教学重点：pBR322 质粒载体的构建、pUC 质粒载体的结构和 TA 克隆载体的构建课时安排：3 学时课前提问：1. 克隆基因的一般过程？2. 重组子、转化子、转化。3. 构建质粒克隆载体的基本策略？20教学难点：pBR322 质粒载体的构建教学内容：第二节 质粒载体（Plasmid Vector ）三、常用的质粒载体 1. pBR322 质粒载体（1）标准的质粒载体命名法则 （2）pBR322 质粒载体的物理图谱（3）pBR322 质粒载体的构建
29、（4）pBR322 质粒载体的优点 2. pUC 质粒载体（1）概述（2）pUC 质粒载体的结构（3）pUC 质粒载体的优点 3. TA 克隆载体 4. 酵母中的质粒载体 复习题 1. 在质粒中如何增减酶切位点？2. 构建质粒载体的基本原则是什么？课堂互动内容“pBR”是指“细菌抗药性质粒”吗？第 10 教学周/第 3.4.5 节 （第 10 次课）教 学 基 本 内 容 备注教学目的：本章主要内容为噬菌体的生物学、 噬菌体克隆载体、柯斯克隆载体、人工染色体克隆载体等内容，要求学生重点掌握 噬菌体克隆载体的相关知识以及温和噬菌体、溶源性细菌、溶源化、整合、原噬菌体和YAC、BAC 等概念。教
30、具：多媒体课件教学重点： 噬菌体克隆载体课前提问：1. pUC 质粒载体的结构特点。2. pBR322 质粒载体的构建过程？21课时安排：3 学时教学难点： 噬菌体克隆外源 DNA 的策略教学内容：第三节 其他克隆载体一、噬菌体概述1. 噬菌体的基本特征2. 噬菌体的结构及其核酸类型3. 噬菌体的感染性（1）噬菌体的溶菌生命周期（2）噬菌体的溶源周期 温和噬菌体（temperate phage） 溶源性细菌（lysogen) 溶源化（lysogenization) 整合（intergration ） 原噬菌体（prophage ）二、 噬菌体克隆载体1. 与构建克隆载体相关的 噬菌体性质 2.
31、 噬菌体作为构建克隆载体材料的依据 3. 构建 噬菌体克隆载体的基本策略4. 噬菌体克隆载体的主要类型5. 重组体 DNA 的体外包装6. 重组体分子的选择方法7. 噬菌体克隆载体的应用 三、柯斯 （cosmid）克隆载体四、 人工染色体克隆载体 1. 酵母人工染色体载体（ yeast artificial chromosome，YAC）2. 细菌人工染色体（bacterial artificial 课堂互动内容所有的噬菌体都能使寄主细胞发生裂解吗？课堂互动内容1. 噬菌体可以直接作为载体来使用？为什么？2. 对照理想载体必须具备的条件，分析如何对 噬菌体进行改造才能使它成为一种理想的载体？2
32、2chromosome，BAC ）复习题1、如何将野生型的 噬菌体改造成为一个理想的载体？2、为什么野生型的 噬菌体不宜作为基因工程载体？3、什么是 YAC? 什么是 BAC？它们有哪些优点？第 11 教学周/第 3.4.5 节 （第 11 次课）教 学 基 本 内 容 备注教学目的：本章主要讲述了外源 DNA 片段同载体分子的重组、受体细胞、重组 DNA 导入受体细胞的方法和转化等知识。需要学生掌握感受态细胞、转化、转染、转化率等概念。教 具：多媒体课件课前提问：1. 噬菌体克隆外源DNA 的策略？2. 什么是 YAC？什么是 BAC？23教学重点：重组 DNA 导入受体细胞的方法课时安排：
33、3 学时教学难点：转化的过程和机理教学内容：第四章 重组体的筛选第一节 重组 DNA 导入受体细胞一、外源 DNA 片段同载体分子的重组1.平末端连接2. 粘性末端连接 衔接体（linker) 结合体 （adaptor) 同聚体加尾 （homopolymer）二、受体细胞1.受体细胞(receptor cell)的概念2.受体细胞的选择原则三、重组 DNA 导入受体细胞的方法1.转化（transformation）2.转染（transfection）3.显微注射技术（microinjection）4.电转化法（electro-tranformation）,也称为电穿孔法（electropora
34、tion）5.基因枪法（gene gun/particle gun） ，又称微弹轰击法（micro-projectile bombardment）6.脂质体介导法（liposome mediated gene transfer）7.花粉管通道法四、转化1.转化的目的（1）大量产生重组 DNA 分子课堂互动内容1.在外源 DNA 片段与载体分子的连接产物中，可能存在几种类型的分子？2. 任何不经特殊处理的细胞都可以吸收外源DNA 分子吗？3. 转化和转染是一回事吗？课堂互动内容：1. 为什么还要将已经重组的 DNA 导入到宿24（2）重组 DNA 分子进行纯化2.受体细胞的感受态（1）感受态细胞
35、（competent cell)的概念（2）感受态的机制局部原生质体化假说、酶受体假说（3）转化的过程（4）转化反应3.转化率 4.转化率的影响因素复习题 1、转化的目的是什么？2、什么是转化？什么是转染？3. 什么是转化率？影响转化率的因素有哪些？主细胞中去呢？2. 在转化产物中，可能存在几种类型的细胞？第 12 教学周/第 3.4.5 节 （第 12 次课）教 学 基 本 内 容 备注教学目的：本次课程主要讲述了与重组子的筛选相关的内容内容，要求学生掌握选择与筛选、转化子与重组子两对课前提问：1.有几种方法可以将重组 DNA 导入受体细胞？25概念的区别以及若干种筛选重组子的方法。教 具：
36、多媒体课件教学重点：重组体的筛选方法课时安排：3 学时教学难点：筛选与选择、重组子与转化子这两对概念的正确理解教学内容：第四章 重组体的筛选第二节 重组体的筛选一、相关概念1. 选择（selection）2. 筛选（screening ）3. 转化子4. 重组子二、重组体的筛选方法1. 遗传表型直接筛选法（1）抗药性筛选（2）插入失活法抗药性基因插入失活法-半乳糖苷酶显色反应（-互补筛选发法）-互补蓝白选择（blue-white screening）A more sophisticated procedure for screening for the presence of recombin
37、ant plasmids, which can be carried out on a single transformation plate, is called blue-white screening. This method also involves the insertional inactivation of a gene and, as the name implies, uses the production of a blue compound as an indicator. The gene in this case is lacZ, which 如何选用？2. 在转化
38、产物中，可能存在几种类型的细胞？课堂互动内容1. 选择和筛选是一回事吗？为什么？2. 转化子都是重组子吗？重组子都是转化子吗？为什么？课堂互动内容：播放蓝白筛选的动画资料，是同学们更加直观地理解这种筛选方法。26encodes the enzyme -galactosidase, then expression of a lacZ gene may be induced using isopropy-D-thiogalactopyranoside (IPTG), and the expressed enzyme can utilize the synthetic substrate 5-bro
39、mo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) to yield a blue product. Insertional inactivation of lacZ in the production of a recombinant plasmid would prevent the development of the blue color.2. 电泳法筛选（1）质粒抽提筛选法（2）限制性酶解法（3）PCR 的方法3. 核酸分子杂交检测法（1）原理（2）分子杂交的分类（3）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交（4）菌落和噬菌斑杂交4. 免疫化学检测法
40、5. 亚克隆法 复习题 1. 建立了一个基因文库后，如何鉴定一个带有目的基因的克隆？2. 为什么要进行重组子的筛选与鉴定工作？第 13 教学周/第 3.4.5 节 （第 13 次课）教 学 基 本 内 容 备注课前提问：27教学目的：本次课程主要讲述基因表达的机制、外源基因表达系统和制约目的基因表达的因素等内容，要求学生掌握表达载体、转基因沉默、共抑制、融合蛋白、包涵体等相关知识。教 具：多媒体课件教学重点：外源基因表达系统课时安排：3 学时教学难点：基因表达的机制和制约目的基因表达的因素教学内容：第五章 外源基因的表达第一节 外源基因的表达体系一、基因表达的机制1. 外源基因的起始转录：可调
41、控的启动子2. mRNA 的延伸与稳定性3. 外源基因 mRNA 的有效翻译4. 表达蛋白在细胞中的稳定5. 目的基因沉默二、外源基因表达系统1概念2原核生物基因表达系统（1）优点（2）大肠杆菌基因表达载体 复制子 启动子和终止子 核糖体结合位点 密码子（简并密码子的选择） 选择标记（抗生素抗性基因）3真核生物基因表达系统三、制约目的基因表达的因素1.蓝白筛选的英文表述？2. 选择、筛选、转化子、重组子等概念。课堂互动内容回顾分子生物学讲过的知识“原核生物转录过程”？课堂互动内容：回顾真核基因的一般结构和复制子、终止子、启动子等相关概念？281外源基因是否插入在正确的阅读框架2目的基因的有效转
42、录（如启动子的作用）3mRNA 的有效翻译（如 SD 序列等作用）4转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程 复习题1. 制约目的基因表达的因素有哪些？如何解决？2. 什么是转基因沉默？哪些因素可以导致转基因沉默？如何避免？3.什么是共抑制？什么是融合蛋白？第 14 教学周/第 3.4.5 节 （第 14 次课）教 学 基 本 内 容 备注课前提问：29教学目的：本章主要讲述与外源基因在原核细胞中表达的 相关知识。要求学生掌握真核基因在原核细胞中表达的困难和采取的措施，以及基因表达产物的检测与分离纯化方法。教 具：多媒体课件教学重点：原核系统高效表达外源真核基因的措施课时安排：3 学时教学难点：真
43、核基因在原核细胞中表达的困难教学内容：第五章 外源基因的表达第二节 外源基因在原核细胞中的表达一、基因工程的表达系统 1. 原核表达系统 大肠杆菌系统 枯草杆菌系统 2. 真核表达系统 低等真核细胞（酵母）系统 哺乳动物细胞系统 昆虫细胞系统 二、真核基因在原核细胞中表达的困难三、原核系统高效表达外源真核基因的措施四、基因表达产物的检测与分离纯化1基因表达产物的检测（1）外源基因转录产物的检测Northern 印迹杂交、RT-PCR（2）报告基因的酶法检测氯霉素乙酰转移酶基因( CAT)葡萄糖苷酸酶基因等( GUS)（3）表达产物生物学活性检测1. 大肠杆菌基因表达载体含有哪些元件？2. 制约目的基因表达的因素有哪些？如何解决？课堂互动：详细讲解真核基因在原核细胞中表达的困难，引导学生思考解决的办法？302基因表达产物的分离纯化复习题 1. 真核基因在原核细胞中表达的困难？如何解决的？2. 基因表达产物的检测与分离纯化方法有哪些？第 15 教学周/第 3.4.5 节 （第 15 次课）
