1、现在仪器分析实验1实验四 高效液相色谱法测定 VE 含量1 实验目的1.1 了解高效液相色谱仪的基本操作；1.2 了解高效液相色谱仪测定 VE 的原理。2 实验原理高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。VE（维生素 E）
2、又名生育酚或产妊酚，在食油、水果、蔬菜及粮食中均存在。有抗氧化作用，能增强皮肤毛细血管抵抗力，并维持正常通透性；有改善血液循环及调整生育功能、抗衰老作用等。V E 通过高效液相色谱柱进行分离，PDA 检测器检测，外标法定量。3 实验器材3.1 实验样品VE 样品溶液3.2 实验试剂浓度为 50g/ml 的 VE 标样3.3 实验仪器高效液相色谱仪附 PDA 检测器4 色谱条件色谱柱：C 18 柱； 流动相速度：0.3ml/min；进样量：5l； 柱温：30。现在仪器分析实验25 实验结果与讨论5.1 实验结果本次实验采用的是单点法测定。实验结果见表 1。表 1. 液相色谱仪测定苹果的 VE 含
3、量进样量 保留时间 峰面积标样 5l 3.59min 42217待测样品 5l 3.59min 17369样品中 VE 的浓度=乙烯标样的总量 苹果的峰面积 /乙烯标样的峰面积=标样进样 量 标样 中 的 浓 度 样 品峰面 积样 品 进样 量 标样 峰面 积=5l50g/mL17369/（5l42217）=20.57g/mL5.2 实验讨论本次实验中，测定标样溶液 VE 含量时，在指定的保留时间内并未出峰。讨论分析原因：样品溶液在上周实验后，一直置于离心管中，未避光低温保存，导致样品中 VE 氧化，液相测定时没有在相应的时间出峰。本次实验时间较短，且主要目的是了解高效液相色谱仪的基本操作，以
4、及液相色谱仪测定 VE 的原理，故结合前组同学对 VE 含量的测定数据进行讨论与分析。因时间有限，实验采用了单点法进行测量分析，且无平行重复，这样误差较大。我们以后实验时，V E 标样可以选择 5 个浓度，每个浓度分别测定 3-4 次，取其峰面积的平均值后作标准曲线，这样误差更小。6 知识扩展6.1 高效液相色谱仪包括哪几个部分组成？答：高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱分离系统、检测器这四个部分组成，其流程图见图 1。输液系统包括贮液槽和输液管道、高压泵和梯度洗脱装置。贮液槽，通常是由玻璃或不锈钢等材料制成的，用来存贮足够数量、符合分析要求流动相的容器。输液管道是管道内径很小的用于
5、连接高效液相色谱仪各主要流路系统。高压泵是将流动相在高压下连续送入色谱柱，使样品在色谱柱内完成分离过程。高效液相色谱仪采用的是往复式恒流泵，是具有输出压力高、流量稳定、流量可调范围宽、泵内死体积小、具有梯度洗脱及耐酸碱腐蚀、溶剂更换迅速等性现在仪器分析实验3能。梯度洗脱装置是在分离过程中，随时间函数程序改变流动相组成，有分低压梯度和高压梯度两种装置。图 1 高效液相色仪流程图进样系统有由进样口、注射器、流通阀和定量管等组成，其作用是使样品有效地送入色谱柱。进样系统是柱外效应的重要来源之一，为了减少对柱高的影响，避免由柱外效应而引起峰展宽。进样口要求死体积小，这样能使样品各组分几乎同时进入色谱柱
6、。色谱分离系统由色谱柱、柱恒温器组成。色谱柱由柱管和固定相构成，分为普通分析柱（内径大约 45mm） 、半制备或制备柱（内径大于 8mm） 、窄柱（内径在 2mm 左右）以及微径柱（内径小于 1mm） ，内径小的色谱柱相对更省溶剂，相对灵敏度更高。柱恒温箱是另一个重要的组成，柱温是液相色谱的重要操作参数。高精度的温度控制对保证色谱柱性能，进行高精度、高重现性的分析是比不可少的。高效液相色谱仪的检测器有紫外-可见光检测器、荧光检测器、示差折光检测器和二极管阵列检测器。6.2 操作高效液相色谱仪时需要注意哪些问题？答：操作高效液相色谱仪时应注意：1）配置样品时要严格按照标准配制对照品浓度（低浓度）
7、 ，不可超过或低于一倍。2）所需玻璃仪器和容器，尽量选用棕色容量瓶进行配制。每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。3）实验前要检查仪器是否存在漏液现象、压力是否稳定、柱子是否安反。检查现在仪器分析实验4完毕后，打开电脑、工作站电源开关后，再打开泵电源开关、控制面板上泵开关。先用色谱甲醇冲洗柱子，等待机器平稳后，再打开检测器电源开关、控制面板上检测器开关。30 分钟后方可进针做实验。4）对照品与样品进样量要尽量保持一致，样品峰面积与对照品峰面积尽量保持一致（不要超过一倍，可适当调整进样量或稀释倍数） 。5）注意系统评价：理论板数（达到标准要求） 、分离
8、度（大于 1.5） 、拖尾因子（0.95-1.05 之间） 。6）平行进针要求 RSD2，进样针每次改进不同样品或对照品时，需用色谱甲醇涮洗五次以上，涮洗位置要超过进样量位置。7）操作过程中，应注意机器异常情况的发生（声音） ，压力是否过高（超过200Bar 不可再做实验） ，流动相是否流空、废液瓶是否已满等等。8）实验结束后，用甲醇冲洗一小时，如果流动相中含有酸或缓冲盐，则先用新鲜纯水冲洗 0.5 小时，再用甲醇冲洗一小时。9）由于实验时间加长，导致对照品与样品保留时间不一致时，在实验最后加进一针对照品，或采用对照品加样品同时进样的叠加法进样，对照峰面积是否为两者之和。6.3 简述高效液相色
9、谱仪常用的检测器及其特点。答：高效液相色谱仪常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧光检测器、示差折光检测器和二极管阵列检测器。其具有：灵敏度高；对各类组分化合物都有响应或有特殊的选择性；线性范围宽；死体积小；不破坏样品；性能稳定，对温度和流速的变化不敏感；能连续工作，可靠方便。紫外-可见光检测器是高效液相色谱中应用最广的的检测器，它对许多样品具有高的灵敏度，最小检测量可达 10-9g。荧光检测器是选择性检测器，用于测定能发出荧光的物质。示差折光检测器是通用型检测器，其利用纯流动相与含有被测组分的流动相之间折射率的差别进行检测。凡具有与流动相折射率不同的组分，均可适用这种检测器。二极管阵列检测器是
10、一种新型检测器相当于紫外-可见光检测器，进入流动池的不是单色光，得到的信号是在所有波长上的三维色谱光谱信号。用以判别色谱分离的状况及强化定量和定性分析。6.4 高效液相色谱的应用氨基酸分析答：氨基酸分析是生命科学研究中最重要的技术之一。多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特性，示差折射检测器对氨基酸也无足够的灵敏度，为提高分析灵敏度和分离选择性，需氨基衍生，衍生的方式有柱前衍生和柱后衍生。因现在仪器分析实验5此，反相高效液相色谱法与各种柱前衍生相结合的氨基酸分析技术，构成了具有广泛适用性的现代氨基酸分析技术柱后衍生离子交换色谱仪具备很高的自动化水平，分离氨基酸在特有柱后氧化及衍生中按固定程序与衍生试剂迅速反应并检测，消除由衍生时间、温度等因素的差异带来的测试误差。衍生试剂不直接进入色谱柱使柱寿命延长，同时还可再生延长离子交换树脂固定相的使用时间。衍生中最常用的是茚三酮柱后衍生法，这种方法几乎能分析所有氨基酸和氨基酸衍生物，蛋白质水解氨基酸之间不存在明显的衍生后灵敏度变化，该法分析技术手段繁多，对样品中存在的杂质适应性好，不足是分析周期时间长。柱前衍生反相分配色谱分析法突出的优点是灵敏度高，分析时间短。
