1、第 1 页 共？页4B4基因在褐飞虱不同发育阶段的表达分析黎璐广州大学生命科学学院摘要 本实验以探究 4B4 基因在褐飞虱不同发育阶段的表达是否存在差异为最终目的，通过对 1 至 4 龄的褐飞虱虫体总 RNA 的抽提、设计 4B4 基因的特异性引物进行 RT-PCR，结合琼脂糖凝胶电泳等系列实验，初步证实褐飞虱在其个体发育的不同阶段 4B4 基因的表达确实存在一定的差异。由此反映出基因的表达调控具有时空特性，在个体发育的进程中，某些基因的表达水平是受到与之平行或相关的调节的。对 4B4 基因随时间推移的个体表达情况作进一步的分析，将有贡献于水稻和褐飞虱的互作研究，为褐飞虱及相类似的水稻害虫的生
2、物防治提供可参考的实验依据。关键词 褐飞虱 基因表达 RNA RT-PCR 琼脂糖凝胶电泳第 2 页 共？页4B4 gene expression analysis in different developmental stages of the brown planthopperLiLuSchool of Life Sciences，Guangzhou UniversityABSTRACT The ultimate goal In this experiment is to explore the expression of4B4 gene in different developmenta
3、l stages of the brown planthopper to see whether differences exist .By extracting the total RNA of 4 kinds of brown planthopper in different life stages , designing 4B4 gene-specific primers for RT-PCR, combined with agar agarose gel electrophoresis and other series of experiments,its initially conf
4、irmed 4B4 gene expression does exist some differences of the brown planthopper in its different stages of ontogeny. Thus reflecting the regulation of gene expression with spatial and temporal characteristics, in the process of ontogeny, the expression levels of certain genes is subject to parallel o
5、r related regulation. Further analysis of 4B4 gene expression for individuals over time will contribute to the studies about the interaction between brown planthopper with rice,and provide an experimental basis for the reference to the brown planthopper and similar biological control of insects of r
6、ice.KEY WORDS Niaparvata lugens Stal; Gene Expression; RNA; RT-PCR; Agarose Gel Electrophoresis第 3 页 共？页目录1 前言 12 材料与方法 52.1 实验材料、器材和试剂 52.1.1 实验材料 52.1.2 实验器材 52.1.3 实验试剂 52.2 实验方法 52.2.1 试剂配制 52.2.2 设计引物 62.2.3 RNA 制备 72.2.4 RT-PCR 反应 72.2.5 琼脂糖凝胶电泳 83 结果与分析 83.1 RNA 的琼脂糖凝胶电泳 93.2 RNA 浓度测定 93.3.RT
7、-PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳 94 讨论 10参考文献 11致谢 12第 4 页 共？页1 前 言水稻是国民生活中最重要的粮食作物之一，水稻的无病无虫害健康生长是高产的主要保障，实际上我国的水稻种植在不同地区以不同幅度和范围经受着各种虫害的打击。其中，褐飞虱(Niaparvata lugens Stal)就是我国长江流域及华南、西南稻区水稻上的主要害虫，它具有迁飞性，因刺吸水稻韧皮部汁液、干扰光合产物的运输,而影响水稻的生长和发育。大量褐飞虱的集中取食会引起水稻的叶片干枯、分蘖枯萎，甚至形成飞虱火烧(hopperburn)，严重影响水稻产量。因此，为改善水稻的生长状况和保证大米的多产优产，探
8、索有效的防治虫害方法显得尤为重要。近年来，生物防治逐渐受到社会的提倡和推广，而水稻和褐飞虱互作关系的发掘是虫害防治研究其中重要的一环。研究者们根据褐飞虱的习性，已经积累和总结了大量的褐飞虱研究资料、数据和经验。作为实验室常用的研究对象，许多基因在褐飞虱生长发育不同阶段的表达研究已有有力的实验证据加以阐述。其中部分研究是针对功能基因的分子作用机理和时空表达水平差异而设置的。例如，我的论文指导老师王小兰等人就研究过好几个基因在褐飞虱体内的表达情况，及其表达产物的功能、生化分子水平的表达调控机制和其与水稻抗虫害的相关性等。参照前人的研究成果，我们可以通过设计相关实验，研究其他感兴趣或证明有研究意义但
9、仍未探索清楚的基因的更深层次的分子机能。4B4 基因就是其中一个我们想要探究的基因，它是一个已知序列的长为470bp 的 DNA 片段，我们可以在 NCBI 等数据库检索到关于它的所有现有的文献和信息。本次实验的内容涵括了基本的基因表达分析方法和步骤，包括如何针对特定的序列设计出特异性强高效反转录引物、如何有效抽提到优质的小型动物体总 RNA、如何进行 RT-PCR 反应、如何制备琼脂糖凝胶再进行电泳等。通过系列实验，可以对基因的表达情况作出一般的初步分析。分别对褐飞虱 1 龄、2 龄、3 龄和 4 龄 4个虫龄的虫体抽取 RNA 作相关实验分析，期望得到呈现一定变化趋势或规律的结果，证明在褐
10、飞虱的不用生长发育状态下，其基因的表达存在差异，也就证明了背第 5 页 共？页后存在一套相应的基因表达调控机制。假设再加以更多的后续研究，也就有可能把整套分子机制摸索出来，那么它的意义和价值是十分可观的。理论上，褐飞虱在取食水稻、特别是抗性水稻后其体内的分子反应机理的研究，将有利于了解褐飞虱如何通过分子水平的调控来对抗水稻的品种抗性，并最终适应新宿主这一现象，为制订科学有效的防治策略提供理论依据。现实意义上，本实验探究 4B4 基因在褐飞虱不同发育阶段的表达分析，可为阐明褐飞虱取食后体内基因水平的调控变化提供一定的实验依据，综合前人的研究成果和现在及将来的研究进展，创新的且更为有效的褐飞虱生物
11、防治方法将运用于水稻的种植生产当中，由此大大提高水稻产量和大米的质量，为社会生活创造不可估量的价值及产生深远的影响。2 材料与方法2.1 实验材料、器材和试剂2.1.1实验材料1 龄、2 龄、3 龄和 4 龄的褐飞虱虫、4B4 基因、液氮、冰块等。2.1.2实验器材冰盒、镊子、研钵、药勺、离心管、离心机、EP 管、移液枪、电子天平、称量纸、烧杯、锥形瓶、量筒、玻璃棒、微波炉、电泳槽、高压灭菌锅、PCR 仪、标签纸、记号笔、一次性手套、一次性口罩等。2.1.3实验试剂Trizol 盐酸、氯仿、异丙醇、75% 乙醇、DEPC 水、TBE 缓冲液、溴乙锭（EB）、10loading buffer、m
12、aker、dd H 2O 等。2.2实验方法2.2.1试剂配制第 6 页 共？页（1）0.1% DEPC 水溶液在 1000mL dd H2O 中加入 1mL DEPC，放置 12h 后灭菌。（2）0.5 TBE 缓冲液0.5（使用液）：0.045mol/L Tris -硼酸 0.001mol/L EDTA（3）1% 琼脂糖凝胶称取 1g 琼脂糖粉末，倒进一洁净锥形瓶内，加入 100mL TBE 缓冲液，震荡混匀。将整个锥形瓶放入微波炉中加热 35min，使琼脂糖粉充分溶解，无可见颗粒出现。戴上隔热手套，从微波炉内取出溶胶，放置 10min，滴加 2L EB，摇匀。准备洁净的胶槽，插好梳子，至
13、溶胶冷却不烫手，倒入胶板内。放置 20min，等到琼脂糖凝胶完全凝固，轻轻拔开梳子，待用。2.2.2设计引物根据 4B4 的基因序列，用 Primer 5.0 软件设计 PCR 引物（如表 1 所示），并交给 Takara 生物公司合成。设计引物通常有以下原则：引物长度一般在 1830bp 的范围内，最佳长度是 2024bp，过长会导致其延伸温度大于 74，不适于 Taq DNA聚合酶进行反应；引物序列中（G+C）%=40%60%，GC 含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的 GC 含量最好不要相差太大；引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3端相似性较高的序列，否则容易导致错配；
14、要注意引物3端若出现 3 个以上的连续碱基，如 GGG 或 CCC，会增加错误引发机率；应当避免在引物的 3端使用碱基 A，因为引物 3端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响，不同的末位碱基在错配位置将会导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基，建议在引物的两端用 12 个嘌呤碱基；5端序列对 PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物；引物二聚体或发夹结构也可能导致 PCR 反应失败，因此应尽量避免每条引物内部形成二级结构及两条引物的 3“端互补形成引物二聚体，避免在引物的 3“端有 3 个 G 或 3 个 C成串排列；引物所对应模板位
15、置序列的 Tm 值在 72左右可使复性条件最佳，可按公式 Tm4(G+C)2(A+T)，或在 Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)计算 Tm 值。两条引物的浓度应该保持一致，其实际用量一般在 550pmoL/50l。Comment a1: 这个设计出来的是结果，放在结果那里。第 7 页 共？页表 1 4B4基因的 PCR引物名称 序列 长度4B4-R-seq283 GAATCATTTGCGACCGGGTG20bp4B4-F-seq460 CGAGGTACATGGGCAGAAAC20bp图 2 用于 RT-PCR反应的引物设计图 1 用 P
16、rimer 5.0 设计的 RT-PCR引物2.2.3 RNA制备（1）准备 1个 50mL离心管，用记号笔标上虫龄。（2）捕捉一定数量 1龄的褐飞虱，装进做好标记的离心管中，放到冰上。（3）将冷冻处理过的褐飞虱倒进研钵里，在液氮中快速充分研磨，直到得到均匀粉末。（4）将所得到的粉末全部收集进已加入 1mL Trizol盐酸的 1.5mL离心管里面，震荡 15s，在 25室温下放置 5min。（5）10000rpm 4离心 15min。Comment a2: 建议以下表格都做成三线表第 8 页 共？页（6）取离心上层清液于新的离心管中，加入 0.5mL异丙醇，在冰上放置 10min。（7）10
17、000rpm 4离心 10min。（8）去上清，得到白色沉淀，往离心管中加入 1mL75%的乙醇。（9）10000rpm 4离心 5min。（10）去上清，打开离心管，自然晾干。（11）干燥以后，往离心管中加入 50L的 DEPC水溶解沉淀。（12）对 2、3、4 龄褐飞虱，重复（1）（12）步骤。（13）将得到的 RNA产品分别用浓度测定仪测量其浓度大小。（14）根据所测得四个虫龄样品的 RNA浓度，用以计算往后 PCR反应各个虫龄RNA产品所要添加的体积，以确保每个起始反应的 RNA含量一致。2.2.4 RT-PCR反应本实验使用 Takara生物技术公司生产的 PrimeScript R
18、T-PCR Kit试剂盒进行系列反应。一、Template RNA变性和反转录反应（1）在 0.5mL EP管中配制反应混合液：dNTP混合液 1L引物 Random 6 mers 1LTemplate RNA 5LRNase free water 3L总体积 10L（2）在 PCR仪上进行变性和退火反应。65 5min4降温（3）在上述反应管中配制下列反转录反应液5buffer 4LRNase Inhibitor 0.5LPrimeScript RTase 0.5LRNase free water 5L总体积 20LComment 微微微微3: 这个电泳图不行，要找一个换掉第 9 页 共？页
19、（4）在 PCR仪上按下列条件进行反转录反应。42 30min95 5min二、进行 PCR反应（1）在 EP管中配制 PCR反应液10buffer 5LdNTP混合液 2L上游引物 1L 下游引物 1LTaq聚合酶 0.5L 反转录反应液 5L水 35.5L（2）按照以下反应条件进行三步 PCR反应94 30s55 30s 30个循环72 1min2.2.5琼脂糖凝胶电泳（1）配制 1%的琼脂糖凝胶，熔胶凝固之后，拔掉梳子，将整块凝胶放进电泳槽中，并浸泡在 TBE缓冲液当中。（2）将 RNA产品或 PCR产品加入 10loading buffer后，分别点样在琼脂糖凝胶的点样孔上，同时点上
20、Marker作电泳结果参照。（3）在 80V工作电压、85mA 工作电流下，电泳 15min。（4）电泳结束后，小心取下琼脂糖凝胶，在凝胶电泳成像仪下观察实验结果。3 结果与分析3.1 RNA的琼脂糖凝胶电泳第 10 页 共？页1 2图2 总RNA凝胶电泳（1、2分别表示1龄和2龄褐飞虱的总RNA）1 2 3图3 总RNA凝胶电泳（1、2、3分别表示2龄、2龄和3龄褐飞虱的总RNA）1 2 3 4第 11 页 共？页图4 总RNA凝胶电泳（1、2、3、4分别表示1、2、3、4龄褐飞虱的总RNA）3.2 RNA浓度测定 提取褐飞虱总RNA后，对溶于等体积DEPC水中RNA含量进行浓度测定，得到表
21、2结果。表2 RNA浓度测定RNA 浓度 g/L A260/A2801 龄 1.6 4.072 龄 23.9 1.443 龄 20.6 1.364 龄 285.3 1.83其中，A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长，而 A280nm 则是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长。A260/A280 比值可对核酸样品的纯度进行评估：纯 DNA 的A260/A280 比值为 1.8，纯 RNA 为 2.0，因此高纯度的 DNA 或 RNA 的 A260/A280 比值应该在 1.8-2 左右。如果 A260/A280 比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。由表 2 可知，4
22、龄褐飞虱的 RNA 浓度是最好的，而 1、2、3龄的继续纯化会更好。由后续的 PCR 反应可知，后来添加的 template RNA 的体积应该根据 RNA 浓度的不同而等比例地增加或减少添加，所以，PCR 反应时要加的 template RNA 体积如表 3 所示。表 3 PCR 反应体积RNA 样品 反应体积/L1 龄 4.382 龄 6.363 龄 54 龄 2.46Comment a4: 直接标上虫龄，不要用 123第 12 页 共？页3.3.RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳1 2 3图 4 RT-PCR凝胶电泳（1、2、3分别表示）1 2图 5 RT-PCR凝胶电泳（1、2分别表示）
23、1 2第 13 页 共？页图 6 RT-PCR 凝胶电泳（1、2分别表示）结果分析4讨论对于以上实验结果，本次实验不算是十分成功。尽管实验证明 4B4 基因在不同发育阶段的褐飞虱体内的表达是存在差异的，但仅凭现有结果仍不能得出这是何种规律，也就无法确切地说这种差异是和生长发育呈线性关系还是相关关系。为什么会出现这样的情况，可能的原因有：实验误差所造成的，可能在实际的操作当中某些意外使然，例如因为 RNA 浓度的不一致，每个虫龄实际加入到 PCR 反应体系中的体积也是不一样的，体积过小的可能会因为没混匀而加少。表达差异的规律就是一条有最值的曲线。为了得到更加有力和充分的依据，可以通过以下方法改进
24、实验的设计来获得想要的结果：4 个龄的划分似乎有点少，可根据需要再多分几个虫龄进行试验，形成 5 到 7 组数据的比较，可能更能显现其中的变化趋势和规律。对于 RT-PCR 产物有无的不确定性，可直接将其送到基因检测中心测序以排除假阳性结果的干扰。琼脂糖凝胶电泳所得到的条带不清晰或不明显，可以换用不同硬度或成分的胶进行不同时长的电泳，将得到的条带在琼脂糖凝胶电泳分析仪下比较，选用最清晰的第 14 页 共？页胶。如若需要作进一步的研究，探明基因功能、基因的表达调控机制或与水稻的互作关系等，还要设计更为全面合理的系列实验。在分子生物学发展日益迅猛的当今时代，相信不久的将来关于基因的更多疑问和未知将
25、被陆续阐明，那也就让人类从中得到更多的启发并获益。至少在生物防治这一点上，相信很快就会研发出新的方法，更加有效又环保地让水稻摆脱自然虫害的威胁。参考文献1 刘美德，洪晓月，杜建光，程退年. 褐飞虱肌动蛋白基因 3 -RACE 及基因表达的RT-PCR 检测J. 南京农业大学昆虫学系, 2003,26(3)：49-51.2 王小兰, 刘顺枝, 何光存, 田长恩. 一个水稻 OsWNK 基因的分离及表达分J. 广西植物, 29(3):404 -407.3 王小兰, 祝彩磊, 祝莉莉, 何光存. 褐飞虱诱导的水稻 cDNA 文库的构建及锌指蛋白基因的分离J. 武汉植物学研究, 2004,22(1):
26、22-26.4 杨之帆,何光存. 褐飞虱 NADH 泛醌氧化还原酶 51kDa 亚基 cDNA 片段的克隆及表达分析J. 武汉科技大学学报,2006,29(3):611-6175 宁淑萍,黄慧润,王小兰. 褐飞虱取食诱导的 MAPK3 基因在水稻叶鞘组织中的定位J.武汉大学, 热带亚热带植物学报 2005，13(5)；381-385.6 杨之帆,何光存.褐飞虱谷胱苷肽转移酶基因 cDNA 片段的克隆、测序及表达分析J.武汉科技大学学报.2007,30(1):99-102.7 张大治,戴沛捷. 蜻蜓目昆虫 DNA 的提取方法研究J. 宁夏农学院学报,2004,25(3):10-12.8 王小兰,
27、刘顺枝,姚焱,杨礼香,何光存. 水稻 OsWNK 基因超量表达载体的构建及转化J. 广州大学学报,2009,8(4):31-34.9 安瑞生,谭声江,陈晓峰.小型昆虫 DNA 提取时匀浆方法的改进.2002，39(4):311-31210 翁清妹,黄臻,王小兰,祝莉莉,何光存. 蛋白酶抑制剂 mRNA 在抗褐飞虱水稻中的原位定位J.科学通报,2003，48(8):827-830第 15 页 共？页致谢在为期一个月时间的实验过程中，我要感谢我的导师王小兰老师以及陈鹏宇师兄给予我耐心的指导和帮助，同样感谢一起做实验的周伟竞同学和林敏深同学，在这段时间里大家互相学习和帮助，保证了实验的进度和质量。衷心感谢和大家一起在实验室奋斗的时光，让我学会了专注、坚持、互相关心和团结合作。谢谢大家的陪伴。
