1、ELISA 操作步骤（双抗体夹心法）1. 包被过程( 注意设置空白对照, 阴性对照):将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入 100l, 置 37,4h, 或 4,24h;弃去孔中液体，( 为避免蒸发 ,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中) 。2 PBS 洗 3 次，每次 3 分钟。具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去） ；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置 1-2 分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤 3 次。3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):检测时一般采用
2、 1:50-1:400 的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量20l。将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔 100l，置于 37,40-60min。4 PBS 洗 3 次，每次 3 分钟。5. 加入酶标抗体:酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37 ,30-60min之间，短于 30min 往往结果不稳定，每孔加 100l。6 PBS 洗 3 次，每次 3 分钟。7. 加入底物液(现用现配):TMB(四甲基联苯胺) 使用液:TMB(10mg5ml 无水乙醇) 0.5ml 底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75H2O2 32l，
3、底物加入量每孔 100l（TMB 空白显色孔除外）,置 37避光放置 20-25 分钟 。8. 终止反应:每孔加入终止液 50l (2M H2SO4)终止反应, 此时蓝色立转黄色， 于 20min 内测定实验结果。9 结果判断:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测吸光值：在 ELISA 检测仪上，TMB 反应产物检测需要 450nm 波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当 P/N 大于 2 时作为抗体的效价即 大于阴性对照吸光值的 2 倍，(数值的大小依具体检测要求而定) 。
