1、实 习 三,实习主要内容 一、肥达氏反应结果观察 二、肠道病原菌的分离与鉴定（二） 三、细菌生长状态及菌落观察 四、金黄色葡萄球菌耐药性的调查（一） 五、小白鼠感染肺炎双球菌实验（录像）,肥达氏反应结果观察,一、观察方法：先看对照组；再从1管开始观察； 观察前勿摇动试管。 二、观察指标：效价 三、结果分析：了解当地人正常效价 消长意义 1.OH 2.OH 3.O H 4.OH 5.OPA 6.OPB,肥达氏反应结果观察,+,+,+,+,-,100%凝集 75%凝集 50%凝集 25%凝集 不凝集,效价：通常以能产生50%凝集(+)的 血清最大稀释倍数做为该血清 的凝集效价。,肥达氏反应结果观察
2、,先看对照管，无凝集现象。细菌自然下沉呈点状。试验管自第1管看起，如有凝集(阳性反应)时则于管底呈圆片状、边缘不整齐的凝集物。其凝集的强弱可用“+”号表示如下： “+” 细菌全部凝集，液体澄清，有大片状，边缘不整齐的凝集片。 “+” 细菌绝大部分凝集，液体有轻度混浊，凝集片较小些。 “+” 细菌部分沉淀于管底，液体半澄清，凝集片呈颗粒状。 “+” 细菌仅少量凝集，液体混浊。 “-” 不凝集。记录结果并判定凝集效价。通常以能产生明显凝集(+)的血清最大稀释倍数做为该血清的凝集效价。轻轻摇动，可见凝块或颗粒浮起，上清透明或有不同程度的混浊。,*轻拿轻放，勿摇动，以免凝块分散。,对照组沉淀细菌呈烟雾
3、状升起，随即消散，液体混浊。H凝集块疏松呈棉絮状，轻摇即升起，易摇碎。O凝块较致密，细小颗粒，轻摇不易摇碎。,结果分析,首先应了解当地正常人效价，一般凝集价超过正常凝集价才有诊断意义。 正常值： TO 1:80 (IgM) TH 1:160 (IgG) PA 1:80 PB 1:80真正的伤寒病人O凝集素(IgM)出现常较H凝集素(IgG)为早，存在于血清内时间较短；H凝集素产生较慢但效价较高，存在时间较长，可达数年。,肥达氏反应辅助诊断伤寒病,单份血清时注意O、H 抗体的区别 OH-伤寒 OH-不是伤寒；免疫机能低下者 OH-感染早期；交叉反应 OH-恢复期；疫苗接种；非特异回忆反应 OPA
4、- 甲型副伤寒 OPB- 乙型副伤寒 双份血清时升高 4 倍以上有诊断意义,过去曾接种过伤寒菌苗或患过伤寒病，近期又感染流感或布鲁氏菌病时，可产生高效价的H凝集素及较低的O凝集素，此种反应称为非特异回忆反应确诊为伤寒的患者中，约有10肥达氏反应始终为阴性，故阴性结果不能完全排除伤寒的诊断 采血时间不同，肥达氏反应的阳性率也不同，发病第一周50，第二周80，第四周90以上。恢复期凝集价最高，以后逐渐下降。一般以双份血清(急性期和恢复期)对比，凝集价有明显上升者作为新近感染的指征,肠道病原菌的分离鉴定（2） 菌落观察-接种双糖铁培养基-试探凝集-革兰氏染色,菌落观察,首先观察菌落是否在划线上，否则
5、可能为污染杂菌菌落。仔细观察两种不同颜色菌落。大小 大菌落(直径在5mm以上) 中等大菌落(直径在3mm左右) 小菌落(直径在1mm左右) 形状：点状、圆形、卵圆形、叶状等。边缘：整齐、锯齿状、毛发状等。表面：光滑、皱纹、湿润、干燥等。隆起度：凸起、扁平、中心凹陷等。结构：均质性、颗粒状等。色调：无色、白色、黄色、褐色等。透明度：透明、半透明、不透明等。,接种双糖铁培养基 成分：葡萄糖、乳糖、FeSO4、硫代硫酸钠、蛋白胨、脲 胨、酚红等。 接种方法： 试探凝集：取可疑病原菌菌落的一部分与沙门菌属多价血清和志贺菌属多价血清分别做玻片凝集反应，观察是否凝集。 方法： 注意事项：1 液体呈滴状，在
6、液体状态下看是否有颗粒状 凝集 2 一种液体取出后接种环灭菌，以防交叉污染 3 菌量不宜过多，轻度混浊即可。,原理：培养基中含有少量葡萄糖和较多乳糖，细菌分解糖类产酸可使培养基局部指示剂改变颜色。当只分解葡萄糖的细菌在斜面上生长时，产生的酸少，在有氧情况下，酸被氧化，生成CO2、H2O，失去局部改变酸碱度的作用，所以斜面不变色。但当细菌分解乳糖时，产生的酸多，故培养基斜面部分变色。细菌在高层中生长时，因处于无氧状态，产生的酸部分解，故使高层部分培养基指示剂变色。肠炎杆菌可利用蛋白胨、脲胨中含硫氨基酸，产生H2S，可与FeSO4反应，生成黑色FeS.,革兰氏染色法,目的： 原理： 实验材料： 1
7、、待测致病菌 2、革兰氏染色液 结晶紫（初染） 芦戈氏碘液 （媒染） 95酒精（脱色）石炭酸复红稀释液（复染） 实验方法： 制片： 涂片 干燥 固定 水洗 水洗 水洗 染色： 初染 煤染 脱色 复染 1min 1min 30s 45s 镜检： 水洗后油浸镜下检查 实验结果：,金黄色葡萄球菌耐药性的调查（一）,一、咽拭子标本金黄色葡萄球菌的增菌培养原理： 正常人群鼻咽腔中能分离出少量定植的葡萄球菌，为 提高细菌的分离率，本实验通过接种固体培养基，增 加细菌菌量。材料：0.9%生理盐水 ；灭菌棉签 ；血琼脂培养基。方法：灭菌棉签蘸少许0.9%生理盐水（已灭菌），伸入鼻腔深 处，反复稍用力旋转擦拭，
8、棉签头在血平板培养基上连 续划线，使细菌接种于培养基中，弃去棉签，37恒温培养培养18小时。 要点：避免棉签过分湿，以免挤入鼻腔盐水；棉签要深入鼻腔，擦拭要用力。,肺炎球菌对小白鼠的感染试验,实验动物的接种 1用消毒好的注射器，按无菌操作法抽取菌悬液后，再用无菌镊子夹一灭菌棉花纸包，将针头刺入棉花纸包内，排出注射器内的气体，然后将注射器平置于试管架上。 2固定小白鼠：用右手轻拖鼠尾，使其爬行于金属网盖上，再突然用左手拇食两指抓紧小白鼠颈项部及两耳，将鼠体搜入手掌中，再用左手无名指和手掌夹住小白鼠尾根，以无名指和小指夹住其左腿。,3以无菌镊子取碘酒棉球，消毒小白鼠左下腹部，用镊子取下注射器针头上的棉花纸包，放入消毒罐中。左手倾斜，使小白鼠头部向下，然后将注射器针头自小白鼠左侧腹股沟部刺入皮下，使针头在皮下组织内前进约l cm左右，再直立注射器，轻轻向F刺入腹腔内，注入菌液02ml后再将针头拔出。将小白鼠用染料涂抹做好标记，放入动物罐中。,示教,葡萄球菌（3种）：菌落1-2 mm、圆形、隆起、表面光滑湿润、有光泽、边缘整齐。长时间培养产生脂溶性色素。绿脓杆菌链球菌（3种）：在血平板上形成灰白色、表面光滑、边缘整齐、0.5-0.75mm细小菌落 。周围有溶血环。,Thank You !,
