1、第 26 卷 第 9 期 农 业 工 程 学 报 Vol.26 No.9292 2010 年 9 月 Transactions of the CSAE Sep. 2010玉米秸秆 湿氧化预处理同步糖化发酵酒精张强1,2，殷涌光1，Anders Thygesen3，Anne Belinda Thomsen3（ 1 吉林大学生物与农业工程学院 ， 长春 130025； 2 长春理工大学生命科学技术学院 ， 长春 130022；3 Biosystems Division, RisDTU, Technical University of Denmark, Roskilde 4000）摘 要 ： 为了找
2、到适合的玉米秸秆生产酒精工艺 ， 该 文采用 碱性 湿氧化预处理 （ 195 ， 15 min， Na2CO3 2 g/L， O21 200 kPa） 与 同步糖化发酵 对玉米秸秆 制备 酒精进行了研究 。 结果表明 ： 经过预处理 ， 90%纤维素保留在固体中 ， 回收率为 95.87%。 固体部分利用纤维素酶处理 ， 在 50 24 h 酶解率达到了 67.6%。 底物 8%（ 质量分数 ） ， 经过 142 h 同步糖化发酵 ， 酒精产量达到了理论酒精产量的 79.0%。 假定五碳糖和六碳糖都能够被利用 ， 相当于 1 t 玉米秸秆能够产生 262.7kg 的酒精 。 发酵过程中没有明显
3、的抑制作用 。 该文为 玉米秸秆 发酵 生产酒精 提供了试验 数据 。关 键词 ： 秸秆 ， 纤维素 ， 乙醇 ， 预处理 ， 同步糖化发酵 ， 湿氧化doi： 10.3969/j.issn.1002-6819.2010.09.048中图分类号 ： TK6 文献标 志 码 ： A 文章编号 ： 1002-6819(2010)-09-0292-04张 强 ， 殷涌光 ， Anders Thygesen， 等 . 玉米秸秆湿氧化预处理同步糖化发酵酒精 J. 农业工程学报 ， 2010， 26(9)：292 295.Zhang Qiang, Yin Yongguang, Anders Thygese
4、n, et al. Ethanol production from wet oxidized corn straw by simultaneoussaccharification and fermentationJ. Transactions of the CSAE, 2010, 26(9): 292 295. (in Chinese with English abstract)0 引 言 燃料短缺以及日趋恶化的环境问题 ， 使乙醇作为可再生资源越来越受到人们的关注 。 以地球上丰富廉价的玉 米秸秆等木质纤维 为 原料生产燃料乙醇已经成为 热门的研究课题 1-3。玉米秸秆是丰富的农业废弃物 ，
5、 但由于其结构复杂很难被降解 ， 因此为提高酶解性首先要进行预处理 。 湿氧化预处理 技术通过对麦秆的试 验证明是很好的预处理方法 。 通过湿氧化预处理 可 使原料中的 纤维素 、 半纤维素和木质素有效分离 、 利于酶水解 。 而且与其他 预处理方法相比 ， 湿氧化预处理过程产生较少的发酵抑制剂 ，例如糠醛 ， 5HMF 及 乙酸等 4-6。目前大部分纤维质原料生产酒精试 验并不是利用真实的水解液 ， 往往在水解液中加入 葡萄糖或木糖 ， 为了验证真实的工艺过程 ， 葡萄糖 或木糖都应来自预 处理后的酶水解液 ， 也就是利用同步糖化发酵法 （ simultaneoussaccharificat
6、ion and fermentation， SSF） 进行酒精发酵 7-10。发酵过程中 作者 采用 生长旺盛 ， 有较强 耐抑制剂能力的活性干酵母 （ S. cerevisiae） 作为发酵菌种 ， 将有利于 实现 工业化生产 。本文 研究了玉米 秸秆在 碱性 湿氧化 （ 195 ， 15 min，收稿日期 ： 2010-01-28 修订日期 ： 2010-04-07基金项目 ： 吉林省教育厅科技项目 （ 200623） ； 吉林省科技发展农业重点项目 （ 20030203）作者简介 ： 张 强 ， 男 ， 副教授 ， 主 要从事生物质能源的研究 。 长春长春理工大学生命科学技术学院 ， 1
7、30022。 Email: 通 信 作者 ： 殷涌光 ， 男 ， 教授 ， 博士生导师 ， 主要从事农产品加工领域研究 。 长春 吉林大学生物与农业工程学院 ， 130025。Email: Na2CO3 2 g/L， O2 1 200 kPa） 条件下 ， 纤维素及半纤维素的回收率以及酶解率 。 在底物 8%（ 质量分数 ） 情况下对活性干酵母同步 糖化发酵 制备 酒精 进行了研究 ， 以便 寻找 适合的玉米秸秆发酵生产酒精的工艺 。1 材料与方法1.1 菌种活性干酵母 （ S. cerevisiae） （ 批号 No.2366） 由 丹麦 Danske Spritfabrikker A/S,
8、 Denmark 生产 。1.2 原料玉米秸秆来自意大利 ， 2004 年 7 月份收获 ， 首先经过气流干燥 ， 然后将原粉碎 成 1 mm 粉 后进行湿 氧化预处理 。1.3 湿 氧化预处理湿 氧化预处理是在丹麦瑞素 国家实验室环型 高压容器中进行的 11。 本试 验所采用的 条件是基于丹麦瑞素 国家实验室以前所做 的 玉米秸秆湿 氧化预处理的基础上进行的 。 195 ， 预处理 15 min 被报道是最佳的条件 12。 将60 g 玉米秸秆 原料 （ 绝干 ） 与 1 L 水混合 ， 并加 入 Na2CO3，通入 O2 ， 具体 试 验条件见表 1， 反应结束后 ， 将预处理液过滤为固体
9、及水解液两部分 ， 分别进行分析 。表 1 玉米秸秆 湿氧化试验设计Table 1 Experiment design of wet oxidation of corn strawpH 值温度/时间/mO2/kPaNa2CO3 质量浓度 /(g L-1) 预处理 前 预处理后195 15 1 200 2 9.18 3.881.4 酶水解取经过预处理后干燥的固体 110 mg， 加入 0.2 mol/L第 9 期 张 强 等 ： 玉米秸秆湿氧化预处理同步糖化发酵酒精 293柠檬酸缓冲溶液 (pH=4.8)。 加入纤维素酶 （ Cellubrix L.）（ 96 IU/mL， Novozymes
10、A/S） 的量为 30 FPU/g（ 干 质量 ） ，50 反应 24 h。 水解后样品于 4 000 r/min 离心 10 min，上清液采用液相色谱分析 。纤维素经酶转化成葡萄糖的百分率 （ ECC） 以下式计算100%1.11cvECC m 式中 ： c 酶水解后的 D-葡萄糖浓度 ， g/L； v 总的体积 ， L； m 酶水解之前纤维素的 质 量 ， g。1.5 同步糖化发 酵 （ SSF）发酵是在 250 mL 玻璃瓶中进行的 。 预处理后的玉米秸秆固体部分与水解液的比例为 8%（ 水解液预先用5 mol/L NaOH 调整到 pH 4.8）。 首先在 50 进行 24 h 预水
11、解 ， 加酶量 10 FPU/g（ 干 质量 ） ， 然后再加入纤维素酶20 FPU/g， 同时加入 0.2 g 干酵母和 0.2 mL（ 24%） 的尿素 。 用 N2 排除发酵瓶中的空气 。 发酵在 32 进行 ， 酒精生成量可 以通过因 CO2 的释放引起瓶质量变化监测 。最终皆通过液相色谱测得酒精浓度及其他成分 。1.6 分析方法1.6.1 原料及湿氧化预处理后的固体成分分析第一步称取约 0.16 g 的原料用 1.5 mL 72% H2SO4 于30 水解 1 h， 然后加入 42 mL 蒸馏水及标准样品 。 第二步 121 水解 1 h 后过滤 。 糖含量可由液相色谱测得 。 固体
12、残留物经过干燥及称 质量 可计算出木质素 的含量 。1.6.2 水解液的分析湿 氧化 预处理后所得的水解液用 8%(w/v) H2SO4 在121 下水解 10 min， 糖的含量 （ 葡萄糖 、 木糖 ） 可由液相色谱测得 。1.7 计算纤维素回收率 (%)=(固体部分纤维素 +滤液中纤维素 )/原料中的纤维素 100%半纤维素回收率 (%)=(固体部分半纤维素 +滤液中半纤维素 )/原料中的半纤维素 100%酒精生成量可以通过因 CO2的释放引起瓶重变化监测 13。酒精产量 = CO2减少量 1.0452 结果和分析2.1 玉米秸秆预处理玉米秸秆预处理后化学组成发生了很大变化 。 从表 2
13、中可以看到 ， 预处理并过滤后主要分为固体部分和水解液两部分 。 100 g 原料玉米秸秆可得 47.54 g 固体 。 预 处理后纤维素质量分数为 34.85%， 而半纤维素和木质素质量分数仅为 4.94%和 6.48%， 与未处理的原料相比 ， 只有极少的纤维素发生了水解 ， 绝大部分纤维素保留在固体中 ， 预处理后固体中纤维素质量分数达到了 73.3%， 而大部分半纤维素和木质素被溶解或分解在水解液中 。 这样有效地解除了对纤维素的束缚 ， 为纤维素进一步酶解创造了有利的条件 。 另外预处理过程中由于半纤维素 、 木质素等降解还产生了部分发酵抑制剂如糠醛 、 5 HMF 以及醋酸和甲酸等
14、物质 。表 2 原料及预处理后玉米秸秆化学组成Table 2 Chemical composition of treated corn straw anduntreated corn strawg (100 g)-1组分 原料玉米秸秆 湿氧化预处理总质量 100 47.54（ 100%）纤维素 38.8 34.85（ 73.3%）半纤维素 22.4 4.94（ 10.4%）固体部分木质素 14.7 6.48（ 13.64%）纤维素 2.28水解液半纤维素 10.372.2 纤维素及半纤维素的回收采用纤维素与半纤维素的回收率来衡量试验条 件下预处理的效果 。 从表 3 中可以看出 ， 纤维素回收
15、率明显地高于半纤维素 。 主要由于半纤维素很不稳定 ， 在高温 、较长时间的湿氧化预处理条件下易分解成羧酸及 H2O 与CO2， 故半纤维素的得率较低 ， 而纤维素的得率较高 。表 3 纤维素与半纤维素的回收率Table 3 Recovery of cellulose and hemicellulose%组分 固体部分回收率 液体部分回收率 总回收率纤维素 90 5.87 95.87半纤维素 22 46.2 68.2纤维素及半纤维素总回收率 862.3 酶解率纤维素的酶解作用是生产酒精的关键步骤 。从表 4 可以看出 ， 预处理原料的酶解率为空白对照的 4.17 倍 。 可见湿氧化预处理有效地
16、改变了固体部分的组成和结构 ， 从而更利于酶水解 。 另外纤维素酶随着作用时间的延长 ， 酶活性会逐渐降低 ， 24 h 后纤维素转化葡萄糖的速度会减慢 。表 4 湿氧化处理后固体部分酶解率Table 4 Conversion of cellulose of remaining solids%处 理 酶解转化率原料 （ 空白对照 ） 16.2湿氧化处理 67.62.4 发酵 过程中酒精 产 量变化利用活性干酵母对底物 8%（ 质量分数 ） 的湿氧化后的混合液进行了同步糖化发酵 （ SSF）， 同时以未处理的原料玉米秸秆作为空白对照 ， 结果如图 1。 酒精产量以 占理论酒精产量的百分比表示 。
17、玉米秸秆经过湿氧化预处理后 ， 经过 142 h 发酵酒精产量达到了理论酒精产量的 79.0%。 而原料玉米秸秆酒精产量仅为理论酒精产量的 27.5%。 但是从图 1 上可以看到 ， 预处理后的玉米秸秆发酵 4 h 左右有滞后期存在 。 主要由于玉米秸秆湿氧化后 ， 木糖降解会产生少量的糠醛等抑制剂 ， 一般来讲 ， 糠醛质量浓度在 1 g/L 会对酵母产生抑制 作用 14 ， 而此发酵液中糠醛质量浓度仅为294 农业 工程学报 2010 年0.14 g/L， 处于亚抑制状态 ， 由于酵母具有很强的脱毒能力 ， 能够代谢糠醛等部分抑制剂 ， 但是不能用来生产酒精 15。 所以酵母利用滞后期主要
18、用来调整或者进行底物脱毒 。 随着发酵进行 ， 糠醛浓度逐渐降低 。图 1 同步糖化发酵过程中 理论 酒精 得率变化Fig.1 Theoretical ethanol yield vs time during simultaneoussaccharification and fermentation (SSF)2.5 同步糖化发 酵 （ SSF）图 2 和图 3 是同步糖化发酵 （ SSF） 过程中葡萄糖 、木糖 、 酒精浓度以及发酵抑制剂醋酸和糠醛浓度变化情况 ， 同时以原料玉米秸秆作为空白对照 。图 2 同步糖化发酵过程中单糖及酒精质量浓度Fig. 2 Concentrations of
19、sugar and ethanol vs time duringsimultaneous saccharification and fermentation (SSF)图 3 同步糖化发酵过程中发酵抑制剂质量浓度Fig.3 Concentrations of inhibitors vs time duringsimultaneous saccharification and fermentation (SSF)从图 2 中可知 ， 经过 142 h 发酵 ， 预处理后的玉米秸秆酒精质量浓度达到了 25.0 g/L。 葡萄糖几乎被耗尽 。 由于活性干酵母不能利用木糖 ， 但是发酵过程中木糖浓度也
20、发生了一些变化 ， 主要由于活性干酵母中含有少量乳酸菌 ， 它能降解部分木糖 。发酵液中含有部分醋酸甲酸等抑制剂 ， 一部分是由于湿氧化处理过程中半纤维素水解形成的 ， 另外在发酵过程中乳 酸菌降解木糖也可产生部分醋酸 。 所以从图 3可以看到无论在湿氧化处理后的玉米秸秆发酵液还是空白对照中 ， 醋酸浓度都随着发酵进行而增加 ， 但较低的浓度不会对发酵产生抑制作用 。 而糠醛浓度逐渐降低 。2.6 理论酒精产量根据计算 ， 玉米秸秆碱性湿氧化预处理后经过同步糖化发酵 ， 假定五碳糖和六碳糖都能够被利用 ， 相当于1 t 玉米秸秆理论上能够产生 262.7 kg 的酒精 。与其他预处理方法相比
21、， 湿氧化预处理过程产生较少的发酵抑制剂 ， 所以发酵过程不需脱毒程序 ， 减少了步骤 ， 降低了成本 。 目前研究虽然利用树干毕赤酵母（ Pichia stipitis） 可同时发酵五碳糖和六碳糖 ， 但该菌对发酵抑制剂敏感 ， 发酵周期长 ， 酒精产量低 。 而采用生长旺盛 ， 耐抑制剂能力强的活性干酵母进行发酵 ， 酒精产量高 ， 有利于实现 工业化生产 。3 结 论1） 玉米秸秆经过碱性湿氧化预处理 ， 90%纤维素保留在固体中 ， 回收率达到 95.87%。 利用纤维素酶处理 ，24 h 酶解率达到了 67.6%， 比原料玉米秸秆酶解率增加了3.17 倍 。2） 底物 8%(质量分数
22、 )， 经过 142 h 同步糖化发酵（ SSF）， 酒精产量达到了理论酒精产量的 79.0%。 假定五碳糖和六碳糖都能够被利用 ， 相当于 1 t 玉米秸秆理论上能够产生 262.7 kg 的酒精 。3） 通过湿氧化预处理后不用脱毒即可直接进行酒精发酵 ， 同时获得了较高的酒精产量 ， 该研究将有利于实现工业化生产 。志 谢 ： 感谢丹麦瑞素国家实验室 Tomas Fernqvist,Ingelis Larsen, Annette Eva Jensen 的技术支持 。参 考 文 献 1 Midilli A, Dincer I, Ay M. Green energy strategies fo
23、rsustainable developmentJ. Energy Policy, 2006, 34(18):3623 33.2 Frank K Agbogbo, Kevin S Wenger. Production of ethanolfrom corn straw hemicellulose hydrolyzate using PichiastipitisJ. Ind Microbiol Biotechnol, 2007, 34(11): 723727.3 Ferrari M D, Neirotti E, Albornoz C, et al. Ethanolproduction from
24、eucalyptus wood hemicellulosehydrolysate by Pichia stipitisJ. Biotechnology andBioengineering, 1992, 40(7): 753 759.4 McGinnis G D, Wilson W W, Mullen C E. Biomass第 9 期 张 强 等 ： 玉米秸秆湿氧化预处理同步糖化发酵酒精 295pretreated with water and high pressure oxygenJ. Ind EngChem Prod Res Dev, 1983, 22(2): 352 357.5 Lis
25、sens G, Klinke H, Verstraete W, et al. Wet oxidation oforganic household waste enriched with wheat straw forsimultaneous saccharication and fermentation into ethanolJ. Environ Technol, 2004, 25(6): 647 655.6 Bjerre A B, Olesen A B, Fernqvist T, et al. Pretreatment ofwheat straw using combined wet ox
26、idation and alkalinehydrolysis resulting in convertible cellulose andhemicelluloseJ. Biotechnol Bioeng, 1996, 49(5): 568 577.7 Olsson L, Hahn-Hagerdal B. Fermentative performance ofbacteria and yeasts in lignocellulose hydrolysatesJ. ProcBiochem, 1993, 28(4): 249 257.8 Klinke H B, Thomsen A B, Ahrin
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30、rga, Helene B, Klinke Kati Rczey, et al. High solidsimultaneous saccharification and fermentation of wetoxidized corn straw to ethanolJ. Biotechnology andBioengineering, 2004, 88(5): 567 574.14 VanZyl C, Prior B A, Preez J C. Production of ethanol fromsugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate by P
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32、 by simultaneoussaccharification and fermentationZhang Qiang1,2, Yin Yongguang1 , Anders Thygesen3, Anne Belinda Thomsen3(1. College of Biological and Agricultural Engineering, Jilin University, Changchun 130025, China;2. School of Life Science and Technology, Changchun University of Science and Tec
33、hnology, Changchun 130022, China;3. Biosystems Division, RisDTU, Technical University of Denmark, Roskilde 4000, Denmark)Abstract: In order to find out the appropriate process for ethanol production from corn straw, alkaline wet-oxidationpretreatment (195, 15 min, Na2CO3 2 g/L, O2 1 200 kPa) and sim
34、ultaneous saccharification and fermentation (SSF)were adopted to produce ethanol. The results showed that 90% of cellulose remained in the solid fraction and recovery ofcellulose was 95.87% after pretreatment. After 24 h hydrolysis at 50using cellulase, the achieved conversion ofcellulose to glucose
35、 was about 67.6%. After 142 h of SSF with substrate concentration of 8%, ethanol yield of 79.0% ofthe theoretical was obtained. The estimated total ethanol production was 262.7 kg/t raw material by assuming theconsumption of both C-6 and C-5. No obvious inhibition effect occurred during SSF. These offered experimentevidences for ethanol production from corn straw.Key words: straw, cellulose, ethanol, pretreatment, simultaneous saccharification and fermentation, wet oxidation
